Пігментосинтезувальна активність бактеріальних та дріжджових клітин за дії важких металів

Пігментосинтезувальна активність бактеріальних та дріжджових клітин за дії важких металів

Здатність до утворення пігментів у мікроорганізмів детермінована генетично і тому може використовуватися як ідентифікаційна ознака.

Продигіозин - один із кількох вторинних бактеріальних метаболітів, що мають незвичайну структуру, у якій метоксибіпірольний фрагмент включений у дипірометиленову структуру. Результати багатьох експериментів показують, що продигіозин діє як аутоокиснений акцептор, тим самим підтверджується його можлива участь у диханні мікроорганізмів. В утворенні продигіозину беруть участь амінокислоти. Припускають, що накопичення амінокислот у середовищі в період стаціонарної фази призводить до більш швидкої появи літичних процесів. Це припущення підтверджує спостереження, що пігментований штам має більш пізній автолітичний процес, ніж безпігментний. Утворення пігменту в цьому випадку можна розглядати як адаптивний процес, викликаний зміною фізіологічного стану клітини. Інша точка зору відносно біологічного значення пірилдіпірилметенових пігментів заснована на їх здатності пригнічувати в лабораторних умовах ріст мікроорганізмів. Великий інтерес становить спостереження, що екзогенний продигіозин є потужним сенсибілізатором для деяких мікроорганізмів.

Піоцианін, який входить до класу феназинових пігментів, являє собою антибіотик бактерій виду Pseudomonas aeruginosa; активний проти всіх грампозитивних бактерій. Механізм утворення феназинового кільця піоцианіну все ще не з’ясований, хоча це питання вивчали кілька груп учених. Ранні досліди Blackwood і Naish на зростаючих культурах Pseudomonas aeruginosa показали, що гліцерин або діоксиацетон є кращими попередниками, ніж глюкоза, ацетат або фенілаланін. Ці дані дозволяють припустити, що піоцианін синтезується з проміжної сполуки, яка містить три вуглецеві атоми. Феназини, що синтезуються одним видом, можуть впливати на інші види та їхні тканини, причому цей вплив здійснюється різними шляхами. Вони одні з найперших бактеріальних продуктів, для яких була показана антибіотична активність проти інших мікроорганізмів. Бактеріостатичні властивості іодиніну та піоцианіну сьогодні вивчені детально. Є дані, що феназини володіють канцеростатичною активністю.

Іншою групою пігментів мікроорганізмів є каротиноїди, які належать до групи природних пігментів, забарвлених у жовтий, помаранчевий та червоний кольори. Специфічною ознакою каротиноїдів є наявність хромофора, що складається із низки кон’югованих подвійних зв’язків, кількість яких визначає характер забарвлення пігменту. Вони синтезуються рослинами, найпростішими, грибами та бактеріями.

Каротиноїдам притаманна антиоксидантна, протипухлинна та імуностимулювальна активності, а ß-каротин є провітаміном жиророзчинного вітаміну групи А. З огляду на це, каротиноїди зазвичай використовуються у виробництві кормів для тваринництва, харчовій та фармацевтичній промисловості, косметології як природні барвники або харчові добавки.

Відомо, що каротиноїди, які входять до складу вегетативних клітин Bacillus, мають жовте забарвлення, а пігменти спор - помаранчеве. Така здатність бактерій роду Bacillus може бути використана для створення біосенсорів. Проте слід зазначити, що прокаріоти та одноклітинні еукаріоти є найменш вивченими з точки зору організмів-сигналізаторів забруднень. На сьогодні новим напрямком досліджень у біоіндикації є використання пігментосинтезувальних бактерій як біоіндикаторів. Мікроорганізми найбільш чутливо реагують на зміни складу середовища та здатні швидко оновлювати біомасу, цим пояснюються переваги їх застосування в біоіндикаційних дослідженнях. Однак клітина прокаріот відрізняється від еукаріотичної клітини не тільки відсутністю ядра і багатьох органоїдів, але й спрощенням розмноження та особливостями дихання і харчування.

Тому метою нашої роботи було здійснити порівняльний аналіз олігодинамічної дії важких металів (ВМ), як одних із найпріорітетніших ксенобіотиків довкілля, на синтез пігменту прокаріотичних і одноклітинних еукаріотичних організмів.

Дріжджі роду Rhodotorula культивували на твердому поживному середовищі Сабуро (бактерії - на МПА). У розплавлені середовища попередньо вносили солі ВМ (у перерахунку на катіон). Засівали мікроорганізми суцільним газоном методом Дригальського. Щільність суспензії становила 107 кл/см3. Культивування проводили в термостаті. Дріжджі та бактерії Serratia marcescens культивували за температури 28-29 0С, Pseudomonas aeruginosa - за 37С.

Облік результатів засівання бактерій на МПА з металами проводили візуально на 2 добу культивування (Ag+ - на 5 добу), дріжджів (та бактерій на середовищі МПА з сульфатом і хлоридом міді) - на 3 добу культивування, порівнюючи дослідні зразки з контролем. Для розрахунку різниці в інтенсивності кольору пігменту (dE) між дослідними чашками та контролем дріжджові колонії фотографували, розміщали фотографії в комп’ютерну програму Adobe Photoshop. Потім визначали показники каналів кольорової моделі (Lab) і в програмі CIEDE 2000 розраховували різницю в інтенсивності кольору пігменту. Статистичну обробку проводили за допомогою комп’ютерних програм «Microsoft Office Excel 2007» і «Statistica 10».

Серед пігментів можуть зустрічатися представники різних класів речовин: каротиноїди, феназинові барвники, піроли, азахінони, антоціани тощо, які здатні виконувати певні функції в клітині (табл. 1).

Дослідження показали, що концентраційні інтервали (КІ) між втратою пігменту та блокуванням росту простежувалися в дріжджових клітин і були в межах від 25 до 90% . Для бактерій S. marcescens КІ були лише для хлориду та сульфату цинку - 16,7 та 20% , відповідно (табл. 2). Дріжджові клітини виявилися дещо чутливішими за бактеріальні щодо дії на них більшої частини важких металів (табл. 3). Концентрації, з яких починалося блокування синтезу пігменту в Rh. aurantiaca Y-1193, були набагато меншими, ніж у бактерій S. marcescens MP-141 (для біхромату калію, нітрату нікелю, хлориду кадмію, хлориду міді, хлориду та сульфату цинку в 3,5, 3, 2, 1,3, 1,25, 4 рази меншими, відповідно). Проте для сульфату міді та нітрату срібла, навпаки, концентрації, з яких блокувався синтез пігментів, були нижчими у А marcescens MP-141, ніж у дріжджів (у 2 та 3 рази, відповідно).

грампозитивний пігмент піоцианін

Таблиця 1 - Характеристика деяких груп пігментів мікроорганізмів

Таблиця 2 - Значення концентраційного інтервалу між втратою пігменту та інгібуванням росту в мікроорганізмів під впливом важких металів

Примітка: -* - не спостерігалося концентраційного інтервалу.

Розрахунок різниці в інтенсивності кольору пігменту показав, що з підвищенням концентрації металів в середовищі значення dE збільшувалося (табл. 4). Так, наприклад, за концентрації хрому 10 мг/дм3 спостерігався суцільний ріст рожево забарвлених колоній А marcescens MP-141, dE дорівнювала 4,0 ум. од. Повністю синтез пігменту блокувався за концентрації Сг6+ 70 мг/дм3, тому dE складала 18,6 ум. од. Дріжджі Як. ажапкаса Y-П93 виявилися в 3,5 разу чутливішими відносно дії хрому на синтез пігменту, ніж А татсе8сет MP-14, і втрачали здатність його синтезувати за концентрації металу 20 мг/дм3, dE була 19,1 ум. од.

Таблиця 4 - Вплив концентраційного ряду іонів металів на інтенсивність кольору пігменту в мікроорганізмів

Примітка:

.        L, a, b - показники каналів кольорової моделі CIE Lab.

2.      dE - різниця в інтенсивності кольору між контролем і дослідом, розрахована за допомогою комп’ютерної програми CIEDE 2000.

Щодо дії ВМ на Ps. fluorescens var. pseudo-iodinum МР-11 та Rh. glutinis Y-1335, найбільш чутливими виявилися бактеріальні клітини (табл. 5).

Концентрації ВМ, з яких починалося інгібування синтезу пігментів, були нижчими у Ps. fluorescens var. pseudo-iodinum МР-11 (у 7,5, 12 та 1,5 разу для хлориду кадмію, сульфату міді та хлориду цинку, відповідно), ніж у Ек. glutinis У-1335. Остання культура проявила найбільшу чутливість за дії іонів хрому, арґентуму та нікелю (за концентрацій 10, 55 та 75 мг/дм3, відповідно, синтез каротиноїдів повністю блокувався). Стійкими дріжджі Ек. glutinis У-1335 виявилися під впливом купруму (сульфату), за концентрації іонів міді 1200 мг/дм3 на чашках спостерігався слабкий ріст безбарвних колоній.

Ек. glutinis У-1335 реагували втратою каротиноїдів із менших концентрацій (порівняно з втратою феназинових пігментів Ps. fluorescens var. pseudo-iodinum МР-11) біхромату калію та нітрату нікелю (у 10 і 2,6 разу, відповідно). Щодо сульфату цинку, то дріжджі виявилися також чутливішими за бактерії, але нітрат срібла спричинив більш токсичну дію на Ps. fluorescens var. pseudo-iodinum МР-11. Олігодинамічна дія купруму (хлориду) на дріжджі Ек. аигаЫшса У-1193 (А) та Ек. glutinis У-1335 (Б) представлена на рис. 1. Іони міді спричинили більш токсичний вплив на дріжджі Ек. аигапкаса, можливо, це пов’язано з тим, що вони синтезують менший спектр каротиноїдних пігментів, які виконують в клітині захисну функцію.

Із проведеного порівняльного аналізу щодо впливу різних концентрацій металів на синтез пігментів прокаріот та одноклітинних еукаріот можна зробити висновки, що дріжджові клітини доцільніше використовувати в біоіндикаційних дослідженнях.

По-перше, це пов’язано з тим, що дріжджі майже для кожного металу мали КІ між втратою пігменту та блокуванням росту. По-друге, дріжджі здатні реагувати втратою пігменту з менших концентрацій металів, ніж прокаріотичні клітини.

Проте індикацію нітрату срібла та сульфату міді доцільніше проводити за допомогою бактерій обох видів, а хлориду кадмію та цинку - з використанням Ps. fluorescens уаг. pseudo-iodinum МР-11.

Отже, отримані результати спонукають нас продовжити дослідження щодо вивчення впливу ксенобіотиків на синтез пігменту мікроорганізмів із метою їх застосування в біоіндикаційних дослідженнях.

Висновки.

1.      Концентраційні інтервали між втратою пігменту та блокуванням росту простежувалися в дріжджових клітин і коливалися в межах від 25 до 90% . Для бактерій S. marcescens MP-141 концентраційні інтервали були лише для хлориду та сульфату цинку - 16,7 та 20% , відповідно.

2.      Розрахунок різниці в інтенсивності кольору пігменту показав, що з підвищенням концентрації металів в середовищі значення dE збільшувалося. Так, за концентрації хрому в середовищі Сабуро 10 мг/дм3 спостерігався суцільний ріст рожево забарвлених колоній S. marcescens MP-141, dE дорівнювала 4,0 ум. од. Повністю синтез пігменту блокувався за концентрації Cr6+ 70 мг/дм3, тому dE складала 18,6 ум. од.

.        Дріжджові клітини виявилися чутливішими за бактеріальні щодо дії на них більшої частини важких металів і реагували втратою пігменту з менших концентрацій металів, ніж прокаріотичні клітини, тому їх можна рекомендувати для біоіндикації важких металів у довкіллі. Проте індикацію нітрату срібла та сульфату міді доцільніше проводити за допомогою бактерій обох видів, а хлориду кадмію та цинку - з використанням Ps. fluorescens var. pseudo-iodinum МР-11.