Освоение методов работы с генетическим материалом

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ. 3

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. 4

1.1 Электрофорез. 4

1.1.1.Техника проведения. 5

1.2. Полимеразная цепная реакция. 7

1.2.1.Специфичность и применение. 7

1.2.2.Проведение ПЦР. 9

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.. 9

2.1. Метод Электрофореза. 9

2.1.1.Материалы.. 9

2.1.2.Методика. 10

2.2  Метод ПЦР. 11

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. 14

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.. 15

ВВЕДЕНИЕ

Завершение полной расшифровки последовательности генома человека привело к возникновению новой области науки — системной биологии. В основе системной биологии лежит моделирование поведения сложных биологических процессов с целью предсказания их дальнейшего поведения.[[1]]

Одним из таких фундаментальных процессов является функционирование живой клетки. Согласно современным представлениям, наиболее адекватным описанием таких процессов являются функциональные сети — модели ансамблей взаимодействующих молекул. Для описания процесса функционирования различных генов в клетке используют генетические сети. Упрощенно генную сеть можно представить в виде многочисленных молекул, которые взаимодействуют друг с другом, обеспечивая, в конечном счете, контроль активности структурных генов и тем самым формирование признаков организма.[1]

Для описания биохимических реакций, происходящих в клетке, используют модели метаболических сетей. Особенностью этих моделей является их сложность, которая может быть описана в иерархическом виде. На нижних уровнях иерархии находятся генетические макромолекулы — ДНК, РНК и белки, а взаимодействия между ними определяют структуру функциональных сетей. Полное и адекватное исследование функций генома невозможно без детального исследования всех уровней его иерархии. Таким образом, в постгеномную эру на передний план выдвигаются задачи определения структур генетических макромолекул, их функций, а также взаимодействий с другими участниками генных и метаболических сетей.[1]

Такие методы как электрофорез (ЭФ) и Полимеразная цепная реакция (ПЦР) составляют первые этапы в исследованиях генетической информации и различных белковых молекул. Т.к. ПЦР - экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе), а ЭФ - это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине) и форме (в случае, если ДНК образует вторичные структуры, например шпильки).[1]

Целью нашего занятия стало – освоение методов работы с генетическим материалом. Из выше поставленной цели следуют следующие задачи: 1. Составить обзор литературы

2. Отработка методов Электрофореза и ПЦР

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Электрофорез

Электрофорез – метод разделения макромолекул, различающихся по таким параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пространственная конфигурация, вторичная структура и электрический заряд.[[2]]

Результатом проведения электрофореза является электрофореграмма -картина, полученная после разделения сложной смеси с помощью электрофореза и специфического проявления. Электрофореграмма белков биологических жидкостей человека (сыворотка крови, моча, спинномозговая жидкость и др.) позволяет врачам получить значительную диагностическую информацию.[2]

Например, у здорового человека относительное содержание белковых фракций при определении их в сыворотке крови методом электрофореза на бумаге, следующее:

альбумины- 55-65%,

α1-глобулины 3-6%,

α2-глобулины 7-10%,

β-глобулины - 7-12%,

γ-глобулины - 13-19%.

При многих заболеваниях наблюдается изменение соотношения фракций, тогда как общее количество белка обычно мало изменяется. Выявление этих изменений с помощью метода электрофореза широко используется в диагностических целях. [2]

Электрофореграммы белков-ферментов (зимограммы) позволяют изучать изменения активности и изоферментного спектра таких белков под действием внешних и внутренних факторов как у человека, так и у других организмов. [2]

Преимущества:

1. Не требуется сложного оборудования

2. Низкая стоимость реактивов

Недостатки:

1. Высокий риск контаминации (загрязнения продуктами предыдущих ПЦР)

2. Требуется дополнительное помещение и персонал для стадии детекции продукта

3. Трудоемкость

4. Только качественный анализ (есть/нет)

Электрофорез ДНК — это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине) и форме (в случае, если ДНК образует вторичные структуры, например шпильки). Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через гель. Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно, к положительному аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее.[[3]]

К образцам обычно добавляют низкомолекулярный кислый краситель (например, динитрофенол, бромфеноловый синий), чтобы визуализировать ход электрофореза в процессе. Краситель также необходим для того, чтобы определить, когда стоит остановить процесс.[3]

Электрофорез проводится в камере, заполненной буферным раствором. Чаще всего используются буферы, содержащие ЭДТА, трис и борную кислоту: TAE и TBE. Буфер необходим для повышения ионной силы раствора, в котором будет происходить разделение молекул ДНК под действием приложенного электрического поля.[3]

После разделения (иногда краситель вносят в расплавленную агарозу) фрагменты ДНК разной длины визуализируют при помощи флюоресцентных красителей, специфично взаимодействующих с ДНК, например, агарозные гели обычно красят бромистым этидием, который интеркалирует между азотистыми основаниями дуплекса и флюоресцирует в УФ-лучах.[3]

Определение размеров производят путем сравнения коммерчески доступных фрагментов ДНК (DNA ladder, «линейка»), содержащий линейные фрагменты ДНК известной длины.[3]

Для электрофоретического анализа ДНК обычно используют агарозные (для относительно длинных молекул ДНК) и полиакриламидные (для высокого разрешения коротких молекул ДНК, например, в случае секвенирования) гели.[3]

1.1.1.Техника проведения

«Методика электрофореза с использованием агарозного геля должна учитывать, что «поры» для разделения макромолекул большого размера, и потому подходят только для молекул, молекулярная масса которых не меньше 200 кДа. К преимуществам агарозных гелей можно отнести относительно быстрое перемещение молекул, но полосы имеют ограниченное разрешение, так как склоны к быстрому размытию границ  и распространению в разные стороны. Процедура электрофореза с гелем проводиться по следующим этапам:[[4]]

• Во-первых, приготовление водного раствора, вид которого зависит от выбора электрофоретического буфера (например, трис – ацетатный, трис – фосфатный, трис – боратный). Конечная рН водного раствора должна составлять 8,0;
• Одновременно с приготовлением водного раствора выбранный буфер при помощи нагревания готовит расплав агарозы с концентрацией 0,4 – 2,0 %;
• Полученный расплав агарозы остужают до 50 градусов, после чего в него добавляют краситель – бромистый этидий в концентрации, которая требуется для дальнейшей визуализации дифференцированных молекул во время ультрафиолетового излучения. Длина волны УФ – света должна составлять 254 нм;
• В горизонтальную кювету помещается 50-ти градусный расплав агарозы, где в последующем за счет гребенки образуются углубления для внесения препаратов ДНК. В подобном состоянии расплав агарозы оставляется до момента достижения консистенции геля;
• После застывания гелеобразных лунок с добавленными препаратами ДНК, кювету помещают в электрофоретическую ванну;
• Одновременно приготавливается навеска гексилрезорцина, который включается в электрофоретический буфер до момента достижения высшей концентрации, составляющей 10-3 М (0,194 г/л). Именно гексилрезорцин или С6 – алкилоксибензол проявляет наиболее выраженные фотопротекторные свойства;
• Буфер с содержанием указанного выше количества и концентрации С6 – алкилоксибензола, погружается также на на электрофоретическую ванну;
• Электрофоретическая ванна соединяется с источником света, на котором заранее установлены показатели режимов электрофореза;
• Источник тока отключается только после прошествии некоторого времени от разделения препаратов ДНК, что определяется получением частиц с разными характеристиками. После разделении молекул ДНК и отключения источника тока гелеобразную массу агарозы переносят на трансиллюминатор;
• На поверхности трансиллюминатора под воздействием УФ – излучения происходит детализации полученного разделения молекул ДНК, и создание документов при помощи цифровых устройств;
• Последним, заключающим этапом является, вырезание участка геля из агарозы с разделенным молкулами ДНК, для проведения последующих генно – инженерных исследований.»[4]

1.2. Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод,  имитирующий естественную репликацию ДНК, "invitro"  аналог биохимической реакции синтеза ДНК в клетке. ПЦР позволяет найти в исследуемом материале небольшой участок генетической информации,  заключенный в специфической последовательности нуклеотидов ДНК любого организма среди огромного количества других участков ДНК и многократно размножить его.  ПЦР позволяет получить количество ДНК, достаточное для детекции.

Область применения:

·   диагностика инфекционных заболеваний;

·   диагностика онкологических заболеваний;

·   диагностика генетических заболеваний;

·   идентификация личности;

·   диагностика патогенов в пище;

·   диагностика ГМО и др.

1.2.1.Специфичность и применение.

ПЦР - метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя.[[5]]

ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем (ИППП).[5]

Также, этим методом проводят диагностику вирусных инфекций, таких как гепатиты, ВИЧ и др. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохомических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антигенной изменчивостью.[5]

Специфичность ПЦР при использовании технологии PCR даже для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.[5]

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.[5]

Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т. д.). В урологической и гинекологической практике - для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллёза, микоплазменной инфекции, ВПЧ - вирусов папилломы человека; в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулёза; в гастроэнтерологии - для выявления хеликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллёза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии - для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов.

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами - короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18 - 30 букв. Каждый из праймеров сопоставим (комплементарен) с одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка. После соединения (гибридизации) матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.[5]

1.2.2.Проведение ПЦР

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

·   ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать;

·   два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента;

·   термостабильная ДНК-полимераза;

·   дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T);

·   ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы;

·   буферный раствор.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции.[5]

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Метод Электрофореза

2.1.1.Материалы

·   «образец ДНК - молекулыднккоторые нужно разделить либо определить их размер, объем 10-20 мкл

·   электрофорезная камера . Камеру можно купить  , но можно и сделать самому.Камера - это просто герметично склеенная коробочка из оргстекла с 2-я штекерами в которые вставляется питание, самое проблематичное здесь - это подобрать блок питания.

·   Источник питания на 50 - 150 В

·    Гель - готовый или сделанный самостоятельно  Для приготовления 1% геля: 100 мл воды и 1 грамм агарозы

·   буфер TAE(Tris-acetate-EDTA), который в разбавленном виде заливается в камеру, объем в зависимости от размеров камеры

·   Loadingbuffer - обычно глицерин, объем 1 мкл
При нанесении в лунки днк ,она сама по себе туда не опуститься, всплывет и рассеится по буферу. Чтобы этого не произошло и нужен глицерин или чтонибудьдругое тяжелое.

·   Loadingdye - краситель , объем 1 мкл
Не обязателен, но позволяет визуально наблюдать за ходом электрофореза ( днк он конечно не покажет )

·    DNA ladder - маркер, по объему - столько же сколько и образца
Необходим для определения размера образца.Маркер - фрагменты ДНК , определенного размера.
Бывают разныеDnaLadder 100 , 50 , 25. DnaLadder 100 - набор фрагментов от 100 нуклеотидов до 1000 с шагом в 100. Обычно наносятся в первую лунку и получаются в виде лесенки. Если нужно только узнать наличие\отсутствие днк в образце , то можно и без маркера. В маркер не нужно добавлять ни Loadingbuffer ни Loadingdye.

·   Трансиллюминатор или ультрафиолетовая лампа(например бытовая люминесцентная черная)Для визуализации подкрашенной этидиумом ДНК.»[[6]]

2.1.2.Методика

«1. Готовят 1 х ТБЭ в объеме, достаточном для заполнения камеры для электрофореза и приготовления геля.

2.Добавляют к 1 х ТБЭ агарозу в количестве, необходимом для получения 0,35—0,45% (в/о) раствора, и нагревают в микроволновой печи до полного расплавления агарозы.

3. Охлаждают смесь до +/- 50 °С.

4.Добавляют к раствору агарозы бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл и осторожно перемешивают, избегая появления в геле пузырьков воздуха.

5. Теплую агарозу выливают в кювету для геля и равномерно распределяют ее по кювете. Вертикально вставляют гребенку так, чтобы ее зубцы не доставали до дна примерно 1,5 мм.

6. Оставляют кювету с агарозным гелем на 30 мин, затем осторожно удаляют гребенку и липкую ленту. Кювету с гелем помещают в электрофорезную камеру, содержащую необходимое количество 1 х ТБЭ с бромистым этидием в конечной концентрации 0,5 мкг/мл.

7. Подготавливают к электрофорезу образцы исследуемой и маркерной ДНК, для чего смешивают их с буфером для нанесения (5:1, о/о). Чтобы получить четкий сигнал при окрашивании бромистым этидием-EtBr, в лунку шириной 5 мм достаточно внести 200 нг маркерной ДНК. Для построения стандартной кривой необходимо использовать маркерные фрагменты, длина которых примерно равна длине исследуемой ДНК.

(EtBr при форезе движется от (+) к (-). Если хочется, чтобы он не уходил из геля, лучше ввести его и в форезный буфер.)

8. Осторожно вносят в лунки исследуемую и маркерную ДНК.для повышения точности определения размера маркерную ДНК наносят по обе стороны от исследуемой.

9. Проводят электрофорез при градиенте напряженности 1—3 В на 1 см геля в течение 1—3 ч.

10. Просматривают гель в УФ-свете на транс иллюминаторе и фотографируют.»[[7]]

2.2  Метод ПЦР

«1. ВЗЯТИЕ, ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА, ДОСТАВКА и ХРАНЕНИЕ МАТЕРИАЛА

1.1. Исследуемый материал (мокрота, плевральная жидкость, моча, бронхоальвеолярный  лаваж, промывные воды бронхов и др.экссудаты) в количеств 10 мл собрать в пластиковую  центрифужную пробирку объемом 50 мл с плотно завинчивающейся крышкой.

1.1.2. Для разжижения мокроты или плевральной жидкости :

1.1.2.1. Приготовить смесь NALC следующего состава ( на 5 проб мокроты):

0.25 г ацетил-цистеина, 25 мл 4% NaOH, 25 мл 0.1М триNa цитрата Смесь готовят в день  использования (раствор не хранится).

1.1.2.2. К образцу в пробирке добавить равный объем NALC, перемешать на вортексе в  течение 5-20 секунд, инкубировать 15 минут при комнатной температуре, а затем развести  0.067М фосфатным буфером (рН 6.8) до 50 мл;

1.2. Центрифугировать 15 минут при 3000 об/мин, удалить надосадочный раствор вакуумным  аспиратором в колбу-ловушку с дез.раствором. Осадок использовать для выделения ДНК.

1.3. К осадку в пробирке добавить 100 мкл дистиллированной воды, пробирку плотно закрыть,  перемешать на вортексе, и перенести весь объем суспензии в чистую полипропиленовую  пробирку типа Эппендорфф объемом 1,5 мл.

Неохлажденные обработанные образцы использовать в течение 2-х часов для выделения ДНК. Допускается хранение при +4…+8оС не более 1 суток, при –18…-20оС—не более 2-х недель.

Доставка обработанных проб в лабораторию должна проводиться в термосе со льдом или в термоконтейнере в течение 12 часов.

2. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ БИОПРОБ

2.1. Пробы (осадок в 100 мкл воды) прогреть 20 мин при температуре 95оС.

2.2. К пробе добавить 300 мкл раствора I и 20 мкл суспензии сорбента. Суспензию сорбента  перед использованием необходимо тщательно перемешать до полной гомогенности.) Пробирки плотно закрыть.

2.3. Пробы инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре, 1-2 раза  перемешивая на вортексе.

2.4. Центрифугировать в течение 15 сек на микроцентрифуге при 8-12 тыс.об/мин.,  супернатант удалить вакуумным аспиратором в колбу-ловушку, с использованием  одноразовых наконечников,.

2.5. К осадку добавить 100 мкл раствора II, пробирки плотно закрыть и встряхнуть на  вортексе. Сорбент осадить центрифугированием при 8-12 тыс.об/мин. в течение 15 секунд. Супернатант удалить вакуумным аспиратором в колбу-ловушку.

2.6. Процедуру отмывки (добавление раствора, встряхивание на вортексе и осаждение  центрифугированием) повторить еще два раза с использованием 1.0 мл раствора III для  промывки.

2.7. Дополнительным центрифугированием при 8-12 тыс.об.мин., с последующим отбрасыванием супернатанта убрать остатки раствора III.

2.8. Пробирки поместить в твердотельный термостат и подсушить пробы 5 мин при  температуре 45-55оС, оставляя пробирки открытыми.

Внимание! На всех стадиях обработки клинического материала удаление супернатанта  производят одноразовыми пластиковыми наконечниками при помощи вакуумного аспиратора в колбу-ловушку, содержащую дезинфицирующий раствор (3% хлорамин или 5% перекись водорода и т.п.)

2.9. В пробирки с сорбентом добавить 50 мкл ТЕ буфера, пробирки плотно закрыть, перемешать на вортексе и инкубировать в течение 5 минут при 45-55оС в твердотельном  термостате.

2.10. Пробирки центрифугировать 15 сек при 8-12 тыс.об/мин, водную фазу (супернатант) использовать в качестве исследуемого образца ДНК для постановки реакции амплификации.

Раствор ДНК (супернатант, перенесенный с осадка сорбента в чистую пробирку), можно  хранить при температуре +4…+8оС в течение недели или при температуре -20оС в течение 6  месяцев.

3. ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР (амплификация)

3.1. Приготовить и пронумеровать пробирки для проведения амплификации вместимостью 0,5 мл (или 0,2 мл) в соответствии с количеством анализируемых проб. Подготовить и промаркировать пробирки для положительного (маркировка «К+») и отрицательного (маркировка «К-») контрольных образцов.

3.2. За 20-30 минут до приготовления рабочей амплификационной смеси извлечь комплект реагентов для ПЦР (амплификации) из морозильника, разморозить содержимое (желательно поместить пробирку с Taq-полимеразой в ледяную баню). Пробирки с реакционной смесью и полностью размороженным раствором разбавителя тщательно

встряхнуть для перемешивания содержимого.

3.3. Из компонентов набора приготовить смесь реагентов для амплификации из расчета на 1 пробу:

Рекомендуется готовить смесь реагентов не менее чем на 5 реакций для достоверной дозировки объема фермента17,5 мкл разбавителя, 2,5 мкл реакционной смеси, 0,2 мклTaq-полимеразы

При приготовлении рабочей амплификационной смеси необходимо все компоненты добавлять отдельными наконечниками.

3.4. После добавления Taq-полимеразы, которое производится в последнюю очередь, необходимо тщательно перемешать смесь пипетированием.

3.5. Добавить по 20 мкл рабочей амплификационной смеси во все пробирки, подготовленные для амплификации.

3.6. Добавить во все пробирки по 1 капле (около 25 мкл) минерального масла.

3.7. Внести 5 мкл образца из обработанной анализируемой пробы (см п. выделение ДНК) в  соответствующую пробирку с рабочей амплификационной смесью под слой масла.

3.8. Внести в пробирки для положительных контрольных образцов по 5 мкл положительного  контрольного образца ДНК, а в пробирку для отрицательного контрольного образца – 5 мкл разбавителя , используя индивидуальные наконечники с фильтрами.

3.9. Пробирки закрыть и центрифугировать в течение 3-5 секунд при 1,5– 3000 об/мин при

комнатной температуре (+18...+25оС) на микроцентрифуге-вортексе.

3.10. Перенести пробирки в прогретый до температуры +93оС (установившаяся температура в  режиме Пауза) программируемый термостат (амплификатор) и провести амплификацию по

следующей программе:»[[8]]

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По окончания занятий по большому практикуму были выполнены следующие задачи:

1. Проанализирована научная  литература.

2. Отработаны  методы Электрофореза и ПЦР

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ