Диагностика мутаций гена BRCA1 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в лечении рака молочной железы

Диагностика мутаций гена BRCA1 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в лечении рака молочной железы

Министерство образования и науки российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Кубанский государственный университет» (ФГБОУ ВПО «КубГУ»)

Кафедра биохимии и физиологии

Заведующий кафедрой

Канд. биол. наук, доцент

В.В. Хаблюк

Выпускная квалификационная работа бакалавра

ДИАГНОСТИКА МУТАЦИЙ ГЕНА BRCA1 МЕТОДОМ ПЦР В ЛЕЧЕНИИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Работу выполнил А.И. Скорикова

Факультет Биологический

Направление Биология 020200.62

Научный руководитель

доцент, канд. биол. наук М.Л. Золотавина

Нормоконтролёр канд. биол. наук, доцент Н.Н. Улитина

Краснодар 2013

РЕФЕРАТ

Квалификационная работа представлена на 30 листах печатного текста и содержит три главы, пять таблиц, шесть рисунков. В работе использовались 24 литературных источника.

Ключевые слова: РАК МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, СЕМЕЙНЫЙ РАК МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И РАК ЯИЧНИКОВ, ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ, МУТАЦИЯ В ГЕНЕ BRCA1.

Работа выполнялась на базе генетической лаборатории Краснодарского онкологического диспансера №1 в период с 26.06.12 по 26.05.13 гг.

Целью исследования было определение закономерностей мутации гена BRCA1 в лечении рака молочной железы.

В данной работе описывается метод ПЦР в реальном времени, его использование в диагностике различных заболеваний, в том числе и определение мутаций в генах, приводящих к возникновению рака молочной железы и рака яичника. В нашей работе была использована ДНК, выделенная из крови 79 больных с диагнозами рак молочной железы и рак яичника. Из них 70 человек имели спорадическую форму заболеваний, что составило 87% и девять человек - наследственную форму - 13%.

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

. Аналитический обзор

.1 Метод ПЦР в реальном времени

.2 Действие генов-супрессоров на формирование опухолевого процесса

.3 Наследственные формы рака молочной железы и рака яичника

.4 Профилактика развития рака молочной железы в Краснодарском крае

. Материал и метод исследования

.1 Материал исследования

.2 Исследование мутации методом ПЦР

.3 Статистические методы и программы

. Диагностика мутаций гена BRCA1 методом ПЦР в лечении рака молочной железы

Заключение

Библиографический список

ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время клиническая лабораторная диагностика занимает важное место в диагностике заболеваний. Наиболее часто в клинической практике врачи обращаются к биохимическим методам, которые позволяют оценить состояние организма и/или отдельных органов, но, к сожалению, эти методы не дают точной и ранней информации о развитии заболевания.

ПЦР в реальном времени − это метод диагностики, который позволяет проверить генетический материал, экстрагированный из исследуемого клинического образца, на наличие в его составе участка чужеродной или изменённой генетической информации. Большим преимуществом ПЦР метода является то, что для анализа требуется ДНК, содержащаяся в клетках организма и поэтому для ПЦР анализа можно брать любую ткань. Одним из анализов является выявление мутации в гене BRCA1, которая приводит к развитию рака молочной железы и раку яичника.

В мире ежегодно выявляется более одного миллиона случаев рака молочной железы, а в РФ свыше 5·103 случаев [Гарин, 2006]. Существенным фактором риска развития рака молочной железы и рака яичника является наследственная предрасположенность. Семейные формы РМЖ и РЯ составляют до 10% всех случаев заболевания. Чаще всего развитие наследственных форм РМЖ и РЯ связано с мутациями в гене BRCA1 [Карпухин, Поспехова, Любченко, 2002].

Актуальность исследования состоит в том, что раннее выявление и постановка диагноза рака молочной железы и рак яичников окажет своевременную в диагностике и лечении заболеваний.

Цель: определение закономерностей мутации гена BRCA1 в лечении рака молочной железы.

В соответствии с целью решались следующие задачи:

1.      Определение вероятности возникновения мутации в гене BRCA1.

2.      Определение зависимости между формами заболевания и возрастом больных.

.        Определение зависимости между формами заболевания и возникновением мутации.

1. Аналитический обзор

.1 Метод ПЦР в реальном времени

Полимеразная цепная реакция - метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов ДНК в биологическом материале (пробе).

Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов.

Метод ПЦР основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований. С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20-40 тысяч пар нуклеотидов.

ПЦР в реальном времени (или количественная ПЦР, англ. <#"650160.files/image001.gif">

Рисунок 1 − ДНК, содержащей мутацию BRCA1 5382insC

Образец считали положительным (содержащим мутацию), если при использовании смесей праймеров 5382-М и 5382-W появлялись кривые амплификации, пересекающие порог флуоресценции с разницей не более чем в 1 цикл (в идеальном случае одна кривая должна накладываться на другую) [Real-time PCR-BRCA1-5382insC инструкция по применению].

На рисунке 2 представлен пример «отрицательной» детекции мутации в гене BRCA1 5382insC.

Рисунок 2 − ДНК, не содержащей мутацию BRCA1 5382insC

Образец считали отрицательным (дикого типа), если при использовании смеси праймеров 5382-W появлялась кривая амплификации, которая пересекает порог флуоресценции не позднее 35 цикла и отсутствовала кривая амппификации при использовании смеси праймеров 5382-М. [Real-time PCR-BRCA1-5382insC инструкция по применению].

2.3 Статистическая обработка данных

Статистическая обработка данных осуществлялась на ПК с помощью программы Microsoft Office Excel 2010 и онлайн калькулятора на сайте биометрики. Для подсчёта статистических данных нами были использованы следующие методы: критерии хи-квадрат [<#"650160.files/image003.gif">

Рисунок 3 - Процентное соотношение больных по мутации в гене BRCA1

Проанализировав полученные данные, мы провели статистический анализ по отягощённости заболевания.

На диаграмме представлено три вида отягощённости, представленные на рисунке 4.

Рисунок 4 - Доля носителей мутации гена BRCA1insC у больных в зависимости от суммы факторов отягощённости

Из данных диаграммы нами было отмечено, что столбец 3 соответствует больным с диагнозом рак яичников, имеет самый высокий процент появления мутации, что составляет 66%; второй столбец - рак молочной железы - 25%, первый столбец - рак молочной железы и рак яичников - 9,5 %. Данные являются достоверно значимые, так как p=0,0025 (р<0,05).

Все средние значения долей мутаций входят в доверительный интервал. Это означает, что риск возникновения мутаций является очень высоким. Для дальнейшего прогнозирования появления мутации в Краснодарском крае проводили скрининговые программы по профилактической программе «Онкоптруль», что позволяет уменьшить риск возникновения мутации и предотвращения развития данного заболевания (подробно указано в 1.4).

В ходе работы был определен процент мутации в двух возрастных группах. Данные представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Процентное соотношение мутации в гене BRCA1 и возрастных группах больных

Таким образом, высокий процент заболевания выявлен во второй возрастной группе больных не несущей мутацию, что составло 66,7%; у больных первой возрастной группе не несущей мутацию составила 15,3% случаев. У больных второй возрастной группе несущей мутацию в 13,8% случаев. У больных первой возрастной группе несущей мутацию проявление заболевание выделено в 4,2%.Это показывает, что высокий процент мутации находится во второй группе.

Из данных таблицы 3 нами была рассчитана доля носителей мутации в возрастных группах (рис. 5).

Рисунок 5 − Доля носителей мутации гена BRCA1 в возрастных группах больных

Таким образом, в первой возрастной группе больных с мутацией (столбец 1) среднее значение входило в доверительный интервал и составила 22%. Во второй возрастной группе больных с мутацией (столбец 2) - 17,5%. Данные являются достоверно значимыми, так как p=0,002.

По происхождению заболевания мы всех больных разделили на диагнозы спорадический и семейный рак молочной железы и рак яичников. Данные представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Процентное соотношение спорадического и наследственного рака молочной железы и рака яичников в возрастных группах больных

Проанализировав данные таблицы 4, мы сделали следующие выводы, что семейная форма рака молочной железы и рака яичников встречаются реже, чем спорадическая форма. В первой возрастной группе больных (25-40 лет) спорадическая форма рака молочной железы и рака яичника составила 92,9%; 7,1% − семейная форма. Во второй возрастной группе больных (41-90 лет) 91,4% − спорадическая форма; 8,6% − семейная. Следует учесть, что подсчёт производился из расчёта 100% на каждую группу больных раком молочной железы и раком яичника, что позволило получить более точное представление о распространении мутации. Это связано с тем, что рак молочной железы и рак яичников может возникать по другим причинам, не связанные с возникновением мутации в гене BRCA1.

Далее, мы определили процентное обнаружение мутаций в разных формах заболевания. Данные представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Процентное соотношение форм заболеваний в семейной и спорадической формах рака молочной железы и рака яичников у больных

Таким образом, из данных таблицы 5 отметили, что преобладала спорадическая форма без мутации рака молочной железы и рака яичников и составила 80,5%. Втором место занимает спорадическая форма с мутацией 11,1%, на третьем месте - семейная форма заболеваний - 8,4%. Данные являются достоверно значимыми, так как p = 0,003.

Проанализировав значения таблицы 5, мы выявили долю носителей мутации в спорадической и семейной форме заболевания. Данные представлены на рисунке 6.

Рисунок 6 − Доля носителей мутации в гене BRCA1 в спорадической и семейной форме заболевания у больных

Таким образом, средние значения доли носителей мутации в спорадической и семейной формах входили в доверительный интервал, что составло в спорадической форме заболевания (столбец 1) 12%, в семейной (столбец 2) 8%. Данные являются достоверно значимыми, так как p=0,002.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Благодаря последним исследованиям в области молекулярно-генетических механизмов наследственной предрасположенности к РМЖ обнаружено, ген BRCA1 несёт мутации, которые связаны с высоким риском возникновения рака молочной железы и рака яичников. Изучена их структура и получена значительная информация о функциональных особенностях. Ген BRCA1 имеет ряд схожих структурных параметров и функциональных проявлений, действует в качестве генов-супрессоров злокачественной трансформации клетки. Наследуемые мутации в гене BRCA1 приводит к риску возникновения рака молочной железы и рака яичников, составляющему 80-90% при выраженных семейных формах этого заболевания. ДНК-диагностика мутаций в гене BRCA1 создаёт новые существенные возможности для медико-генетического консультирования, профилактики и лечения.

Следуя поставленной цели, мы выделили следующие закономерности:

. В нашем исследовании у больных раком молочной железы и раком яичников мутация в гене BRCA1 5382insC возникала в 18% случаев.

. Высокий процент заболевания выявлен во второй возрастной группе больных не несущей мутацию, что составло 66,7%; у больных первой возрастной группы не несущей мутацию составила 15,3% случаев. У больных второй возрастной группы несущей мутацию в 13,8% случаев. У больных первой возрастной группы несущей мутацию проявление заболевание выделено в 4,2%.

. Среди форм заболеваний высокий процент имеет спорадическая, что составляла 80,5%; а спорадическая форма заболевания с мутацией - 11,1%, в случае семейной формы заболевания - 8,4%.

Для дальнейшего прогнозирования появления мутации необходимо проводить скрининговые программы по территории Краснодарского края, что позволит уменьшить риск возникновения мутации и предотвращения развития данного заболевания.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1.      Вычисление критерия Хи-квадрат для таблиц сопряжённости 2х2 (без поправки Иэйтса). Режим доступа: <http://biometrica.tomsk.ru/freq1.htm> (3.03.2013).

2.      Галуев Р.Э., Шелякина Т.В., Мхитарьян О.В. Скрининговая диагностика рака и предраковых заболеваний ободочной кишки. Современные технологии в онкологии: материалы VI Всероссийского съезда онкологов. М., 2005. С. 187-188.

.        Гарин А.М. Повышение выживаемости и качества жизни больных раком молочной железы - достижимая задача // Онкология. 2006. № 11. С. 28-30.

.        Геворкян Ю.А., Дашков А.В., Солдаткина Н.В., Петров Д.С. Улучшение качества жизни больных раком молочной железы после органосохраняющего лечения с интраоперационной химиотерапией на аутосредах организма // Сибирский онкологический журнал. 2008. № 2. С. 37.

.        Злокачественные новообразования в России в 2011 году (заболеваемость и смертность) / под ред. В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. М., 2012. 260 С. 5.

.        Ильницкий А.П. Санитарно-просветительная работа в профилактике рака в России // Российский онкологический журнал. 2003. № 6. С. 49-51.

.        Инструкции по применению набора для выделения ДНК из цельной крови.

.        Карпухин А.В., Поспехова Н.И., Любченко Л.Н. Частоты однонуклеотидных полиморфизмов и мутаций в гене BRCA1 при наследственно обусловленном раке молочной железы и яичников. 2002. № 5. Тверь, С. 1-4.

.        Ковалев Б.Н., Попова А.А., Старинский В.В. Нормативная база становления онкологического скрининга в России. Организационные вопросы ранней диагностики, профилактики злокачественных новообразований и паллиативной помощи онкологическим больным: материалы Всерос. научн. конференции. Казань, 2001. С. 123-129.

.        Летучих Е.В., Сасина М.С. Организационные аспекты проведения профилактических мероприятий среди целевых групп // Здравоохранение Российской Федерации 2007. № 5. С. 41-43.

.        Логинова А. Н.. Молекулярно-генетический анализ наследственной формы рака молочной железы и/или яичников: диссертация; [Место защиты: Государственное учреждение "Медико-генетический научный центр РАМН"]. Москва, 2004. 103 с.

.        Михайлов Э.А., Сагайдак В.Н., Голубева Е.А. Программа обучения женщин самообследованию молочных желез // Вопросы онкологии. 1990. С. 1095-1099.

.        ПЦР в реальном времени / Д.В. Ребников, Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимов и др. - 3е изд. - М.: Бионом. Лаборатория знаний. 2011. 223 с.

15.    Точный критерий Фишера вероятностей. Режим доступа: <http://www.vassarstats.net/tab2x2.html> (29.03.2013).

16.    Chapman P. B., Hauschild A., Robert C. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. New Engl. J. Med., 2011. Vol. 364. P. 2507-2516.

.        Farooq A., Walker L J., Audisio R. A. Cowden syndrome . Cancer Treat Rev, 2010. - Vol. 36. P. 577-583

.        Gerber P. A., Antai A. S, Neumann N. J. et al. Neurofibromatosis II Europ. J. Med. Res., 2009. Vol. 14. P. 102-105.

.        German J., Sanz M. M., Ciocci S. et al. Syndrome-causing mutations of the BLM gene in persons in the Blooms Syndrome Registry II Hum. Mutat, 2007. Vol. 28. P. 743-753.

.        Grudinina N. A., Golubkov V. I., Tikhomirova 0. S. et al. Prevalence of widespread BRCA1 gene mutations in patients with familial breast cancer from St. Petersburg II Russ J. Genet, 2005. Vol. 41. P. 318-322.

.        Hansson J. Familial cutaneous melanoma. Med. Biol., 2010. Vol. 685. P. 134-145

.        Knudson A. G. Cancer genetics / Amer. J. Med. Genet, 2002. Vol. 111. P. 96-102.

.        Kurian A. W. BRCA1 and BRCA2 mutations across ran and ethnicity: distribution and clinical implications info Opin. Obstet. Gynecol., 2010. Vol. 22. P. 72-78.

.        Real-time PCR-BRCA1-5382insC инструкция по применению.