Методы определения N-концевой аминокислоты
Методы определения
N-концевой аминокислоты
Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф.
Для определения природы N-концевой аминокислоты
предложен ряд методов, в частности метод Сэнджера (F. Sanger), основанный на
реакции арилирования полипептида 2,4-динитрофторбензолом (ДНФБ), что приводит к
образованию окрашенного в желтый цвет 2,4-динитрофенильного производного
N-концевой аминокислоты . Раствор полипептида обрабатывают ДНФБ, который
взаимодействует со свободной NH2-группой N-концевой аминокислоты пептида.
После кислотного гидролиза продукта реакции – динитрофенилпептида
только одна N-концевая аминокислота оказывается связанной с реактивом в виде
2,4-динитрофениламинокислоты (стабильной при гидролизе). В отличие от других
образовавшихся при гидролизе полипептида свободных аминокислот она желтого
цвета. Ее идентифицируют методом хроматографии.
Для определения N-концевой аминокислоты значительно
более широко применяется фенилтиогидантоиновый метод Эдмана благодаря своей
высокой чувствительности и возможности многократного использования в одной и
той же пробе. Фенилизотиоцианат реагирует со свободной α-NH2-группой
N-концевой аминокислоты полипептида с образованием фенилтиокарбамоилпептида.
Обработка продукта реакции кислотой приводит к
циклизации и освобождению фенилтиогидантоина N-концевой аминокислоты, природу
которого устанавливают хроматографически. Укороченный на одну аминокислоту
полипептид подвергают дальнейшему анализу.
Эту процедуру ступенчатого расщепления пептида с
N-конца можно повторять многократно, идентифицируя последовательно одну
аминокислоту за другой. Метод Эдмана используется в качестве химической основы
для определения первичной структуры белков и пептидов. Он реализован в
специальном приборе – секвенаторе (от англ. sequence – последовательность),
работающем в автоматическом режиме и позволяющем определить последовательность
аминокислот с N-конца пептида до 50–60 аминокислотных остатков.
Кроме этих реактивов, для определения чередования
аминокислот используют цианат калия, 1-диметиламинонафтил-5-сульфонилхлорид –
дан-силхлорид и дабсилхлорид. Для этих же целей иногда применяют ферменты
экзопептидазы, в частности аланин- и лейцинаминопептидазу. Эти ферменты
разрывают пептидные связи с того конца полипептида, где имеется свободная
NН2-группа, освобождая N-концевую аминокислоту (механизм действия экзопептидаз
см. в главе 12).
Список литературы
Для подготовки данной работы были использованы материалы
с сайта http://www.xumuk.ru/