Иммуноблотинг при диагностике губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота
МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ
"Витебская ордена "Знак Почета"Государственная
академия ветеринарной медицины"
Реферат
на тему:
ИММУНОБЛОТИНГ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ГУБКООБРАЗНОЙ
ЭНЦЕФАЛОПАТИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Красочко П.А., Притыченко А.Н., Бойчук С.В.
Витебск 2011
Cодержание
Введение
Иммуноблотинг (Western-blott)
Принцип диагностики ГЭ КРС с помощью иммуноблотинга
Техника постановки иммуноблотинга
Учёт и интерпретация результатов
Заключение
Список использованных источников
Введение
Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота (ГЭ КРС) представляет собой медленно прогрессирующее заболевание крупного рогатого скота с необыкновенно длинным инкубационным периодом, преимущественным поражением нервной системы и неизбежным летальным исходом. Характерным признаком ГЭ КРС является обнаружение дистрофических изменений с вакуолизацией нейронов в головном мозге, что делает мозговую ткань похожей на губку. Подобные заболевания встречаются и у других животных, а также у человека. Ввиду сходства клинических признаков и патоморфологических изменений эти заболевания объединены в группу трансмиссивных губкообразных энцефалопатий (ТГЭ). В настоящее время к группе ТГЭ относят следующие заболевания животных: ГЭ КРС, скрепи, трансмиссивную энцефалопатию норок, губкообразную энцефалопатию кошек, хроническую изнуряющую болезнь оленей и лосей, а также заболевания человека: болезнь Крейтцфельда-Якоба (БКЯ), синдром Герстманна-Штраусслера-Шейнкера (СГШШ), летальную семейную бессонницу, куру, невыясненную БКЯ (нв БКЯ). Единичные случаи ТГЭ встречаются у экзотических зоопарковых животных - обезьян, тигров, пум, диких жвачных.
Особую тревогу вызывает возможность адаптации приона ГЭ КРС к организму человека. Недавнюю вспышку на БКЯ в Великобритании связывают именно с преодолением межвидового барьера прионом ГЭ КРС. Считается, что заражение происходило при употреблении в пищу продуктов, содержавших PrPSc от больных коров. Это подтвердили исследования, показавшие неразличимость возбудителей на БКЯ и ГЭ КРС.
Для предупреждения развития эпизоотии ГЭ КРС на территории Республики Беларусь важным мероприятием является проведение систематических диагностических мероприятий. Перспективным направлением в диагностике ГЭ КРС является применение иммуноблотинга.
Иммуноблотинг (Western-blott)
Иммуноблотинг - разновидность гетерогенного иммунного анализа.
Назначение:
1) идентификация белков, в том числе вирусных антигенов;
) идентификация антител.
Метод используется для диагностики губкообразной энцефалопатии (спонгиоформная энцефалопатия, бешенство коров) крупного рогатого скота. Существуют различные производители тест-систем, например, тест-системы "Western-Blot" фирмы "Prionix" (Швейцария). Особенностью тест-системы "Western-Blot" является то, что для проявления реакции используются моноклональные антивидовые антитела, меченные щелочной фосфатазой, а субстратной смесью является флуорохром, взаимодействующий со щелочной фосфатазой, и в результате реакции появляется люминесценция, выявляемая с помощью рентгеновской пленки.
Сущность. Метод основан на комбинации гель-электрофореза и реакции антиген-антитело. Сущность его заключается в переносе молекул исследуемого вещества с одного твердого носителя, используемого для фракционирования биополимеров, на другой, где с помощью иммунохимической реакции происходит их специфическое выявление. В зависимости от исследуемого вещества различают ДНК-, РНК - и белок-блотинг. Высокая степень разрешения достигается за счет электрофоретического разделения белков, глико - и липопротеинов и максимальной специфичностью детектирующих иммунных сывороток или моноклональных антител. Замена вышеуказанных меченых антител на меченые антитела пероксидазой позволяет удешевить учет реакции и повысить ее чувствительность и специфичность.
Основные этапы постановки.
Технически иммуноблотинг выполняется в три приема:
иммуноблотинг энцефалопатия рогатый скот
1) подлежащие анализу белки подвергаются разделению в полиакриламидном геле методом электрофореза в присутствии денатурирующих веществ: додецилсульфата натрия или мочевины. Этот процесс часто обозначают как SDS-PAGE, при котором разделенные белки могут визуализироваться после окрашивания и сравниваться с эталонными образцами;
) разделенные белки переносятся с геля электрофоретически путем наложения (блотинга) на нитроцеллюлозный фильтр, помещённый в специальную камеру, и фиксируются на нём, во многих случаях, но не всегда при переносе сохраняются количественные соотношения белков;
) на фильтры наносятся детектирующие поли - или моноклональные антитела, содержащие радиоизотопную или ферментную метку. На блоты наносят антитела к специфическому антигену, отмывают и добавляют радиоактивномеченный конъюгат для определения связавшихся с антигеном антител. Для обнаружения связавшихся антител применяют также антивидовую меченую сыворотку, иными словами, на заключительном этапе блотинг аналогичен твердофазным иммунологическим тестам. После повторного отмывания лист нитроцеллюлозы помещают в кассету с рентгеновской плёнкой для авторадиографии. На проявленной плёнке видны полосы локализации антигена, связавшего меченые антитела. Метод более удобен при использовании конъюгатов с ферментом.
Принцип диагностики ГЭ КРС с помощью иммуноблотинга
Патологическая изоформа прионного белка (PrPSc) в отличие от всех остальных белков мозга устойчива к протеиназе К. Это свойство используется для его выделения: после обработки протеиназой К в пробе остаётся только PrPSc, если проба положительная, либо не остаётся никаких белков, если проба отрицательная.
Для определения молекулярной массы белков пробы после обработки протеиназой К проводят их электрофорез в агаровом или полиакриламидном геле. Скорость перемещения белков в геле при электрофорезе зависит от их заряда и молекулярной массы. С целью упрощения иммунодетекции разделённые в электрофорезе белки переносят из гелей на мембрану при помощи процедуры блотинга. Принцип её заключается в том, что белки извлекаются из геля под действием электрического поля и сразу же адсорбируются на мембране.
Для определения иммунологических свойств перенесенных на мембрану белков проводят обработку мембраны антителами, специфичными к PrPSc, затем промывают антивидовыми антителами, мечеными ферментом. При нанесении на мембрану субстратной смеси она разлагается ферментом с образованием окрашенного или люминесцирующего продукта реакции, в зависимости от вида применяемых ферментов и субстратных смесей. Если на мембране присутствует PrPSc, происходит связывание с ним вначале первых, а затем вторых антител. При разложении ферментом, коньюгированным со вторым антителом субстратной смеси, окрашенный, либо люминесцирующий продукт реакции образуется в месте расположения прионного белка.
Таким образом, PrPSc выявляется в иммуноблотинге с учётом трёх характеристик: устойчивости к протеиназе К, определённого размера молекул при электрофорезе (27-30 kDa) и связывания со специфическим антителом.
Техника постановки иммуноблотинга состоит из следующих этапов:
Øотбор проб;
Øгомогенизация пробы;
Øферментное разрушение пробы;
Øэлектрофорез;
Øблотинг;
Øобработка антителами;
Øпроявление реакции;
Øучёт реакции;
Øинтерпретация результатов.
Техника постановки иммуноблотинга
Отбор, гомогенизация и ферментное разрушение пробы.
Отбор проб. Для диагностики губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота используется продолговатый мозг животных. Отбор проб производится через отверстие затылочной кости с помощью специальной ложечки.
Гомогенизация. Кусочек продолговатого мозга из области задвижки массой 0,45-0,7 г помещают в 50 мл пробирку и с помощью весов определяют точный вес пробы. К кусочку мозга добавляют 10-кратный объём буфера для гомогенизации. Затем проба гомогенизируется в течение 1 мин при помощи гомогенизатора при 20000 об/мин.
Ферментное разрушение. В связи с тем, что прион PrPSc устойчив к протеиназе К, важным моментом является его ферментация. Для этого в 96-луночный планшет с объемом лунки 0,2 мл для ферментного разрушения вносят по 100 мкл каждого гомогената, добавляют 10 мкл протеиназы К (20 ЕД/мл) и хорошо перемешивают пипетированием. Ферментное разрушение проводят при 48°С в течение 40 мин. После инкубации добавляют 10 мкл останавливающего раствора для остановки протеолитической реакции.
Электрофорез.
Принцип электрофореза белков в геле основан на явлении пространственного разделения белков при их движении в электрическом поле. Белки, как биополимеры, обладающие зарядом, перемещаются в электрическом поле в направлении противоположно заряженного полюса. При этом скорость миграции белков в геле зависит от их заряда и молекулярной массы. Поскольку эти характеристики различны у разных белков, методом электрофореза можно добиться разделения сложной белковой смеси на отдельные белки.
Денатурация. Денатурация белков приводит к нарушению вторичной и третичной структур белка, разворачиванию" молекулы. При этом заряд белка, его линейные размеры и, следовательно, скорость миграции белков в геле становятся прямо пропорциональны их молекулярной массе, что даёт возможность точно её определить, сравнивая электрофоретическую подвижность исследуемого белка с электрофоретической подвижностью белков с известной молекулярной массой. Для этого к разрушенным протеиназой К пробам добавляют PAGE-буфер по 100 мкл на лунку с целью подготовки проб для электрофореза, хорошо перемешивают пипетированием и инкубируют при 96°С в течение 5 мин. Контрольный образец инкубируют при 65°С в течение 2 мин. Старые пробы, которые уже были проинкубированы при 96°С в течение 5 мин, также инкубируют при 65°С в течение 2 мин.
Состав буфера для подготовки проб для электрофореза (40 мл):
Нанесение исследуемых проб на гель.10 мкл контрольного образца наносят на первую дорожку геля. На остальные дорожки наносят по 10 мкл исследуемых проб. Внутреннюю и наружную камеры электрофоретической камеры заполняют буфером для электрофореза NuPAGE MOPS/SDS и добавляют 500 мкл антиоксиданта (NOVEX) только во внутреннюю камеру (рис.7).
Состав буфера для электрофореза:
Электрофорез. Электрофорез проводят при 200 V в течение 30 мин, пока краска не окажется на расстоянии 1-2 см от края геля.
Блотинг.
Подготовительные этапы:
·необходимо смочить PVDF-мембрану (Millipore, Immobilon-P, 0,45 мкм) метанолом в течение нескольких секунд, затем поместить в буфер для блотинга на 10 мин;
·камеру для блотинга следует наполнить охлаждённым (+4 °С) буфером для блотинга.
Состав буфера для блотинга (10х):
Трис 30,28 гГлицин144,13 гДистиллированная водадо 1000 мл
Перед использованием к 100 мл 10х буфера для блотинга добавляют 900 мл дистиллированной воды и 100 мл метанола. Хранят при + 4 °С.
·на губку помещают лист фильтровальной бумаги, смачивают его бидистиллированной водой, и наверх кладут мембрану;
·извлекают гель из рамки, удаляют его верхнюю часть, содержащую прорези, и нижнюю часть ниже фронта краски. Гель аккуратно помещают на мембрану, избегая попадания пузырьков воздуха между ними. До 6 гелей может быть помещено на 1 мембрану размером 15 х 18 см;
·наверх на гели кладут смоченный бидистиллированной водой лист фильтровальной бумаги, затем - губку;
·Собранный сэндвич помещают в пластиковую кассету, закрывают её и помещают в камеру для блотинга. Кассету следует вставлять таким образом, чтобы PVDF-мембрана была обращена к положительному полюсу, а гели - к отрицательному (рис.9).
Блотинг проводят при 150 V в течение 1 часа при +4 °С при постоянном охлаждении.
Окраска белков. Мембрану удаляют и окрашивают связавшиеся с ней белки при помощи Ponceau S. Затем мембрану промывают буфером TBST до исчезновения красной окраски.
Состав буфера TBST:
NaCl8,0 гKCl0,2 гТрис3,0 гДистиллированная вода до 1000 млТвин-200,5 млбуфера TBST доводят до 7,4 при помощи соляной кислоты.
Обработка антителами.
Блокирование. Для блокирования неспецифически связывающих участков мембраны её инкубируют с блокирующим буфером (5% раствор сухого молока в фосфатном буфере) в течение 0,5 часа при комнатной температуре с постоянным помешиванием на качающейся платформе.
Обработка первыми антителами. После блокирования неспецифически связывающих участков мембраны на неё наносят сыворотки, специфичные к прионному белку. Для этого используют:
поликлональные антисыворотки к тканям мозга крупного рогатого скота;
-моноклональные антитела - 6Н4, SAF 70, F89/160.1.5.
Применение поликлональных антител снижает чувствительность реакции и ее специфичность из-за наличия в ней антител к тканям мозга, которые взаимодействуют с неразрушенными протеиназой К отдельными белками мозга крупного рогатого скота.
Для постановки реакции более эффективно использовать моноклональные антитела. Для этого 10 мкл мышиных моноклональных антител растворяют в 50 мл TBST (разведение 1: 5000). В полученный раствор антител помещают мембрану и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа (или 12-18 часов при +4 °С) с постоянным помешиванием на качающейся платформе. Мембрану промывают TBST 3 раза по 5 мин.
Детекцию реакции можно проводить путем использования антимышиных антител, меченных щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена.
Обработка коньюгатом со щелочной фосфатазой.10 мкл антител козла против иммуноглобулинов мыши, меченных щелочной фосфатазой растворяют в 50 мл TBST (разведение 1: 5000). В полученный раствор антител помещают мембрану и инкубируют при комнатной температуре в течение 0,5 часа с постоянным помешиванием на качающейся платформе. Мембрану промывают TBST 5 раз по 5 мин.
Обработка коньюгатом с пероксидазой хрена. Проводится аналогично обработке коньюгатом со щелочной фосфатазой.
Проявление реакции.
Нанесение субстратной смеси для индикации щелочной фосфатазы. Мембрану помещают на 5 мин в 50 мл люминесцентного буфера. Растворяют 100 мкл CDP-Star (12,5 мМ, 50-кратный концентрат) в 5 мл люминесцентного буфера. Мембрану помещают на стекло, на её поверхность наносят 5 мл раствора CDP-Star, распределяют его равномерно по всей поверхности мембраны и инкубируют 5 мин при комнатной температуре. С поверхности мембраны удаляют субстрат при помощи мягкой ткани. На мембрану в темноте или при красном свете накладывают рентгеновскую плёнку, помещают в светонепроницаемую кассету и выдерживают при комнатной температуре примерно 5 мин. Рентгеновскую плёнку проявляют и проводят интерпретацию полученных результатов.
Нанесение субстратной смеси для индикации пероксидазы хрена. Реакция визуализируется путем нанесения на мембрану субстратной смеси (раствор диаминобензидина 0,5 мг/мл и перикиси водорода 0,5 мг/мл в фосфатном буферном растворе pH 7,4) до появления полос. Реакция останавливается промыванием мембраны водой. После высушивания мембраны на воздухе проводится учет результатов.
Фосфатный буферный раствор 0,1 М, рН 7,4:
NaCl 8,0 гKH2PO4 0,2 гNa2HPO4 2,8 гKCl0,2 гВода дистиллированная До 1000 мл
Учёт и интерпретация результатов
При использовании конъюгата со щелочной фосфатазой. Контрольный образец даёт на рентгеновской плёнке тёмную линию в районе 32-35 kDa, отрицательные пробы не дают сигнала, либо наблюдается темная чёрточка протеиназы К в районе 31 kDa, положительные пробы дают тёмную линию в районе 27-30 kDa.
При использовании конъюгата с пероксидазой. После обработки субстратной смесью мембрана приобретает светло-коричневую окраску за счёт взаимодействия с субстратной смесью неспецифически связавшегося с мембраной конъюгата. Маркеры молекулярной массы видны в виде белых полос на светло-коричневом фоне. Контрольный образец даёт на мембране тёмную линию в районе 32-35 kDa, отрицательные пробы не дают специфического сигнала в виде тёмной линии, наблюдается светлая чёрточка протеиназы в районе 31 kDa, положительные пробы дают тёмную линию в районе 27-30 kDa.
Преимущества и недостатки:
Преимущества:
)прямое определение наличия возбудителя;
2)высокая специфичность;
)высокая чувствительность - в оптимально отработанных условиях иммуноблотингом можно обнаруживать антиген в количествах менее 1 нг в испытуемом объеме, до 20 нг прионного белка в мозге больных губкообразной энцефалопатией животных;
)высокая скорость полученного результата анализа;
)время блотинга путем диффузии составляет 36-48 ч. Но наиболее быстрый и эффективный способ переноса белков с гелей - электроблот, время которого в основном составляет 1-3 ч, для некоторых высокомолекулярных белков - более 12 ч.
Недостатки:
)сложность постановки;
2)высокая стоимость тест-систем и сопутствующего оборудования.
Заключение
Применение иммуноблотинга для диагностики ГЭ КРС позволяет эффективно диагностировать это заболевание с учётом трёх характеристик его возбудителя: устойчивости к протеиназе К, определённого размера молекул при электрофорезе (27-30 kDa) и связывания со специфическим антителом.
Список использованных источников
1.Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: учебник. - СПб: Специальная литература, 1998. - 592 с.
2.Красочко П.А. Иммунология: учебное пособие / П.А. Красочко [и др.]; под ред. П.А. Красочко, Н.Д. Лисова. - Мн.: Аверсэв, 2005. - 128 с.
.Ройт А. Иммунология: учебное издание / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл; Перевод с английского. - М.: Мир, 2000. - 592 с.
.Ярилин А.А. Основы иммунологии: учебник. - М.: Медицина, 1999. - 608 с.