Содержание SH-групп и активность тирозинаминотрансферазы при рабдомиолизе у крыс с различным эмоциональным статусом
«Содержание SH-групп и активность
тирозинаминотрансферазы при рабдомиолизе у крыс с различным эмоциональным
статусом»
СОДЕРЖАНИЕ
Реферат
Список сокращений
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Тирозинаминотрансфераза
(ТАТ) E.C.2.6.1.5 <#"557477.files/image001.gif"> <#"557477.files/image002.gif"> 
|
|
|
|
тиолы (меркаптаны)
|
тиоэфиры
|
тиоальдегиды
|
тиокислоты
|
Тиопроизводные обладают более сильными кислотными свойствами; некоторые
очень токсичны [17].
Наиболее многочисленны соединения S(II), где сера выступает как аналог
кислорода. Тиолы или тиоспирты R-S-H представляют собой серосодержащие аналоги
спиртов.
.2.2 Cвойства
Свойство тиолов «гасить» свободные радикалы нашло применение в создании
радиопротекторов - веществ, защищающих от радиоактивного излучения.
Сераорганические соединения входят в состав многих современных лекарственных
средств, среди них самую большую группу образуют сульфаниламидные препараты -
производные сульфоновой кислоты. Обладают высокой антимикробной активностью -
сульфаниламид, позже получивший название стрептоцид. Известны и S-содержащие
лекарственные препараты, которые не относятся к группе сульфаниламидов,
например, производное сульфанилмочевины - бутамид стимулирует работу
поджелудочной железы, и потому его применяют при лечении диабета [26].
.2.3 Биологическая роль
Серосодержащие группы, обладая высокой реакционной способностью, входят в
состав активных центров гормонов, ферментов, рецепторов. Например, окисление
сульфгидрильных групп аденилатциклазы уменьшает, а восстановление - увеличивает
ее активность, что может направленно изменять уровень циклических нуклеотидов,
выполняющих функцию вторичных передатчиков в организме. Имеются данные о важной
роли сульфгидрильных групп в мышечном сокращении, делении клеток, окислительном
фосфорилировании, перекисном окислении, радиационном поражении, нервной
деятельности, в частности в нейромедиаторных процессах. Исследования последних
лет убедительно свидетельствуют о наличии в a-адренорецепторах и М-холинорецепторах
высокореактивных сульфгидрильных групп, а в бета-адренорецепторах и
Н-холинорецепторах - дисульфидных связей, воздействие на которые изменяет
рецепторную активность. В современной фармакопее имеется большое количество
препаратов, механизм действия которых заключается во взаимодействии с
сульфгидрильными группами и дисульфидными связями (блокаторы, тиоловые
соединения). Особенно широкий спектр терапевтического воздействия имеют
препараты другого химического строения - тиолы, т.е. соединения, содержащие
свободные сульфгидрильные группы. Механизм действия тиолов заключается,
во-первых, в их способности разрывать (восстанавливать) дисульфидные связи
патологических субстратов и, во-вторых, инактивировать и связывать токсические
агенты, а также повышать содержание сульфгидрильных групп в организме.
Экспериментальными исследованиями установлено, что дитиолы обладают
антиоксидантными свойствами и блокируют реакции перекисного окисления [23].
В организмах животных и человека сера выполняет незаменимые функции:
обеспечивает пространственную организацию молекул белков, необходимую для их
функционирования, защищает клетки, ткани и пути биохимического синтеза от
окисления, а весь организм - от токсического действия чужеродных веществ.В
организме человека сера непременная составная часть клеток, активних центров
ферментов, гормонов, в частности инсулина, и серосодержащих аминокислот
(цистеина, цистина, метионина), биологически активных веществ (гистамина,
биотина, липоевой кислоты и др.) [22].
Биологически-активные серосодержащие соединения (БАСС), такие как
глутатион, цистеин, метионин, липоевая кислота, содержащие тиоловые (SH-)
группы, играют важную роль в физиологических и биохимических процессах в
организме человека и животных. Особую роль тиоловым соединениям отводят при
рассмотрении их в качестве компонентов неферментативного звена антиоксидантной
защитной системы организма наряду с мочевой, аскорбиновой кислотами, различными
формами токоферола. Присутствующие в организме тиоловые соединения в первую очередь
подвергаются действию активных кислородных радикалов, что предохраняет от их
действия функциональные группы биологических молекул и клеточных мембран.
Другим важным свойством тиоловых соединений является их способность
образовывать комплексные соединения с ионами металлов (Hg2+, Сd2+, Ni2+,Cu2+).
Это позволяет защищать организм от токсичного действия «тиоловых ядов». Уровень
суммарного содержания тиоловых соединений в биологических объектах может
выступать в качестве показателя оксидативного стресса и детоксикации организма
[8].
.2.4 Cеросодержащие аминокислоты
В состав белков человека входят 2 аминокислоты, содержащие серу, -
метионин и цистеин. Эти аминокислоты метаболически тесно связаны между собой.
Метионин - незаменимая аминокислота. Она необходима для синтеза белков
организма, участвует в реакциях дезаминирования, является источником атома серы
для синтеза цистеина. Метальная группа метионина - мобильный одноуглеродный
фрагмент, используемый для синтеза ряда соединений. Перенос метильной группы метионина
на соответствующий акцептор называют реакцией трансметилирования, имеющей
важное метаболическое значение.Метальная группа в молекуле метионина прочно
связана с атомом серы, поэтому непосредственным донором этого одноутлеродного
фрагмента служит активная форма аминокислоты - S-аденозилметионин (SAM) -
сульфониевая форма.
Вторая серосодержащая аминокислота - цистеин. Она условно заменима, так
как для её синтеза необходим атом серы, источником которого служит незаменимая
аминокислота метионин. Для синтеза цистеина необходимы 2 аминокислоты: Серин -
источник углеродного скелета; Метионин - первичный источник атома S. Цистеин
играет необычайно важную роль в фолдинге белков. При этом 2 остатка цистеина
формируют молекулу цистина. Восстановление SH-групп часто происходит с
использованием. Глутатион способен существовать в 2 формах - восстановленной
(Г-SH) и окисленной (Г-S-S-F) и служит активным антиоксидантом в организме
человека. Цистеин также служит предшественником тиоэтаноламинового фрагмента
HS-KoA (кофермента А) [21].
.2.5
Сульфгидрильные группы
Тиоловые группы, SH-группы органических соединений обладают высокой и
разнообразной реакционной способностью: легко окисляются с образованием
дисульфидов, сульфеновых, сульфиновых или сульфокислот; легко вступают в
реакции алкилирования, ацилирования, тиол-дисульфидного обмена, образуют
меркаптиды (при реакции с ионами тяжёлых металлов), меркаптали, меркаптолы (при
реакции с альдегидами и кетонами). Они играют важную роль в биохимических
процессах. Сульфгидрильные группы кофермента, липоевой кислоты и
4-фосфопантетеина участвуют в ферментативных реакциях образования и переноса
ацильных остатков, связанных с метаболизмом липидов и углеводов; у глутатиона
играют роль в обезвреживании чужеродных органических соединений, восстановлении
перекисей и в осуществлении его коферментных функций. В белках эти группы
принадлежат остаткам аминокислоты цистеина. В составе активных центров ряда
ферментов сульфгидрильные группы участвуют в их каталитическом действии, в
связывании субстратов, коферментов и ионов металлов. Каталитическая роль этих
групп ферментов заключается в образовании промежуточных соединений с
субстратами (или их остатками) или в переносе электронов и протонов от субстратов
к акцепторам (в некоторых окислительных ферментах). Блокирование
сульфгидрильных групп при помощи специфичных реагентов вызывает частичное или
полное торможение активности многих ферментов. Расщепление дисульфидных связей
приводит к нарушению нативной структуры белков и утрате ими биологической
активности [24].
Существует феномен высвобождения небелковых сульфгидрильных групп
(SH-групп) в результате образования иммунных комплексов в реакциях
антиген-антитело. По количеству образовавшихся небелковых SH-групп можно
оценивать функциональное состояние специфических белков, например,
иммуноглобулинов.Свободные небелковые SH-группы в основном находятся в
депонированном состоянии, образуя смешанные дисульфидные связи с белками.
Появление небелковых SH-групп можно использовать в диагностических целях - для
оценки функционального состояния белков острой фазы [12].
Высокая дегенерация в дофаминергических нигростриатных нейроных взрослых
самцов WV / WV мышей сопровождается значительными изменениями (тиоловых
редокс-состояниях) -TRS и увеличение перекисного окисления липидов в среднем
мозге, предполагая участие окислительного стресса в дегенерации
дофаминергических нейронов. Они также подтверждают возможности использования
тиоловых антиоксидантов для разработки новых нейропротекторных терапевтических
стратегий для нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона
[41].
.3 Рабдомиолиз
Рабдомиолиз - это распад мышечных волокон, который приводит к
высвобождению содержимого мышечного волокна, миоглобина, в кровь.
Освободившиесь продукты распада миоцитов вредны для почек и часто приводят к их
повреждению. Когда мышца повреждена, миоглобин поступает в кровоток и
фильтруется из организма через почки. Миоглобин распадается на потенциально
опасные соединения. Он может блокировать структуры почки, вызывая повреждения,
такие как острый тубулярный некроз или почечную недостаточность. Мертвые ткани
мышц могут вызвать поступление большого количества жидкости из крови в мышцы,
уменьшая объем жидкости в организме и приводя к сотрясению и уменьшению притока
крови к почкам. Болезнь может быть вызвана любым условием, которое приводит к
повреждению скелетных мышц.
Факторы риска: алкоголизм (с последующими тремором мышц), некоторые
наследственные или генетические синдромы, аварии, непереносимость жары,
тепловой удар, ишемия или некроз мышц (которые могут произойти с артериальной
окклюзией, глубокий тромбоз вен, или другие условия), низкий уровень фосфатов,
судороги, тяжелые напряжения, такие как марафон или гимнастика, озноб, травмы,
использование или передозировка наркотиков, особенно кокаина, амфетаминов,
статинов, героина, относящиеся к медицинским состояниям, таких как диабет или
заболевание щитовидной железы, нарушение обмена веществ, таких как кетоацидоз.
Симптомы: Ненормальный цвет мочи (темная, красная), общая слабость,
скованность мышц или боль (миалгия), слабость пораженных мышц. Дополнительные
симптомы: усталость, боли в суставах, судороги, увеличение массы тела
(непреднамеренно) [32].
.3.1 Биохимия
Первичным диагностическим показателем рабдомиолиза является повышенный
уровень креатинфосфокиназы (КФК), по крайней мере в пять раз от нормального
значения [43]. Это увеличение, как правило, до такой степени, что инфаркт
миокарда и другие причины увеличения КФK исключены. Кроме того, изофермент
КФК-ММ преобладает при рабдомиолизе, его содержание составляет по меньшей мере
98% от общего объема [37]. Другое важное открытие, которое часто можно увидеть
при рабдомиолизе, - это миоглобинурия. Миоглобин обнаруживается в моче при сывороточной
концентрации от 300ng/ml до 2 г / мл и производит видимую пигментурию в
концентрациях, превышающих 250 г / мл [42]. Это изменение цвета вызвано
миоглобином плюс метмиоглобином в моче. Другие важные биохимические результаты
в рабдомиолизе включают гиперкалиемию, гипокальциемию, гиперфосфатемию,
гиперурикемию, и повышенный уровень других ферментов мышц, в том числе
актатдегидрогеназы, альдолазы, аминотрансферазы и карбоангидразы III (которая
является очень специфическим маркером для травм скелетных мышц) [43].
Метаболического ацидоз может возникнуть в результате высвобождения фосфатов,
сульфатов, мочевой кислоты и молочной кислоты из мышечной клетки [37].
.3.2 Этиология
Причинами
могут быть: синдром длительного сдавления <#"557477.files/image006.gif">
Рис.1. Химические реакции, которые генерируют АФК.
Окислительный стресс может изменить гормональную регуляцию. Окисление
глюкокортикоидных рецепторов (ГР) in vitro тетратионатом привело к образованию
дисульфидных мостиков в белке. Это окислительное ингибирование ГР было обратимо
тиол-восстановительным агентом дитиотреитолом. Было показано, что Н2О2 вызывает
образование дисульфидных связей между двумя близкими остатками цистеина
расположеными в пределах ГР ДНК-связывающих доменов (DBD). Этот эффект был
предотвращен предшественником глутатиона N-ацетилцистеином. Крысы, получавшие
соединения, полученные из линолевой кислоты (вызывая эндогенный окислительный
стресс печени) показали измененный гормональный ответ. В этих условиях гены ТАТ
и триптофан-2,3-диоксигеназы показали низкий ответ на глюкокортикоиды.
Окислительная модификация тиоловых фрагментов цистеина
Цистеин может претерпевать химические модификации своих тиоловых
SH-групп. Атом серы может окисляться АФК или соединениями, содержащими
дисульфидные мостики (RS-SR), такие как дисульфид глутатиона. SH ковалентная
связь затем заменяется SO или SS ковалентной связью, что приводит к образованию
сульфаниловой, сульфиниловой или сульфоновых групп, или дисульфидного мостика
соответственно. Эти модификации обратимы при антиоксидантых реагентах,
содержащих редуцированную тиоловую группу, такую как дитиотреитол,
б-меркаптоэтанол, N-ацетилцистеин или глутатион.
Рис. 2. Окислительная модификация тиоловых фрагментов цистеина
Рис. 3. Защитные механизмы для реактивации окисленных транскрипционных
факторов
Молекула Trx играет роль глутатиона и может уменшить окисленные тиоловые
группы. Окисленный Trx регенирируется Trx-редуктазой. При окислительном стрессе
Trx переносится в ядро, где может непосредственно взаимодействовать с
транскрипционным фатором (TF) или участвовать в окислительно-восстановительном
каскаде содержащим Ref. Этот механизм позволяет максимально эффективно
опосредовать генную транскрипцию несколькими транскрипционными факторами [40].
ГЛАВА 2.
ОХРАНА ТРУДА
Охрана труда - это система правовых, социально-экономических,
организационно-технических, санитарно-гигиенических и лечебно-профилактических
мероприятий и средств, направленных на сохранение здоровья и работоспособности
человека в процессе труда.
Статья 43 Конституции Украины, закрепляя право граждан на труд,
одновременно устанавливает, что данное право должно осуществляться в условиях,
отвечающих требованиям безопасности и гигиены. В 1992 г. в Украине был принят
Закон «Об охране труда», определивший основные положения по реализации
конституционного права граждан на охрану их жизни и здоровья в процессе
трудовой деятельности.
Согласно статье 159 («Обязанность работника выполнять требования
нормативных актов об охране труда») работник обязан: знать и выполнять
требования нормативных актов об охране труда, правила обращения с машинами,
механизмами, оборудованием и другими средствами производства, пользоваться
средствами коллективной и индивидуальной защиты; соблюдать обязательства по
охране труда, предусмотренные договором и правилами внутреннего трудового
распорядка предприятия, учреждения, организации; проходить в установленном
порядке предварительные и периодические медицинские осмотры; сотрудничать с
собственником или уполномоченным им органом в деле организации безопасных и
безвредных условий труда, лично принимать посильные меры по устранению любой
производственной ситуации, создающей угрозу его жизни или здоровью или людей,
которые его окружают, и окружающей природной среде, сообщать об опасности
своему непосредственному руководителю или другому должностному лицу [2].
В лабораториях биологического профиля действует следующая инструкция по
охране труда, обязательная для всех работающих в лаборатории. К работе в
лабораториях биологического профиля допускаются лица не моложе 18 лет,
прошедшие медицинское освидетельствование, после изучения настоящей инструкции.
Сотрудники, работающие в лабораториях биологического профиля, должны проходить
инструктаж по охране труда не реже одного раза в 6 месяцев, а также аттестацию
по охране труда и электробезопасности. Студенты проходят инструктаж перед
началом выполнения практикума в каждом семестре. Студенты и сотрудники обязаны
выполнять требования ОТ и соблюдать правила внутреннего распорядка. В каждой
лаборатории на видном месте должна находиться аптечка, которая содержит
необходимые медикаменты для оказания первой медпомощи (бинты стерильные,
растворы йода, 2 % раствор двууглекислой соды, 5 % раствор лимонной кислоты,
перманганат калия, нашатырный спирт). Рабочее место в лаборатории должно
содержаться в чистоте. На рабочем месте должны находиться только необходимые
для конкретной работы реактивы, приборы и оборудование. Запрещается
загромождать проходы и доступы к электрощитам, вытяжным шкафам, лабораторным
столам, выходам. Все используемые в лаборатории электроприборы должны быть
заземлены. Присоединение проводников должно быть выполнено сваркой или надежным
болтовым соединением. Студенты приступают к выполнению работы только после
осмотра рабочего места руководителем (преподавателем, лаборантом) и получения разрешения
на ее проведение. Запрещается пребывание студентов в лаборатории без
присутствия преподавателя (лаборанта). Во время выполнения работы запрещается
оставлять без присмотра даже на непродолжительное время работающие установки,
включенные электроприборы, газовые горелки и др. Все работы в лаборатории
производить только в спецодежде (халате), при мытье посуды необходимо надевать
резиновые перчатки, особенно при спользовании хромовой смеси или
концентрированных щелочей. При работе в лабораториях кафедры могут
использоваться жидкости и вещества, пары которых способны вызвать отравление
(формалин, эфир, хлороформ, кислоты и т.д.), поэтому следует строго выполнять
требования техники безопасности при работе с химическими веществами I - IV
класса опасности. Все работы с вредными веществами производить под тягой при
спущенных рамах. Запрещается нюхать и пробовать на вкус неизвестные вещества и
растворы, набирать ртом жидкости в пипетку. Все хранящиеся в лабораториях
реактивы должны быть внесены в опись с указанием названия, количества, степени
очистки, снабжены этикетками с четким указанием названия вещества, для раствора
- его концентрации. Запрещается пользоваться реактивами без этикеток или с
неясными подписями на них. Необходимо внимательно следить за сохранением
чистоты реактива, ни в коем случае нельзя путать пробки от банок с реактивами,
доставать вещество из банки грязным шпателем. Запрещается сливать в раковины
отходы химреактивов и органических растворителей, отходы тяжелых металлов и их
соединений и также других токсических веществ, их следует собирать в
специальные емкости, снабженные соответствующими надписями. По окончании работы
необходимо отключить аппаратуру, газ, воду, освещение, вентиляцию,
электроустановки, проверить герметичность сосудов с летучими веществами,
опустить дверцы вытяжных шкафов, убрать рабочее место. При возникновении
аварийных ситуаций следует немедленно прекратить работу и поставить в
известность администрацию (зав. кафедрой, декана и др.). В случае коротких
замыканий электрооборудования необходимо немедленно отключить питающее
напряжение на главном электрощите. При наличии запаха газа следует открыть
форточки, в помещении не зажигать огня, не включать освещение внутри помещения,
выключить все нагревательные приборы и обесточить электрооборудование общим
рубильником вне помещения. До полного проветривания помещения, устранения места
утечки газа к работе не приступать. Разлитые кислоты и щелочи, горючие жидкости
необходимо немедленно засыпать песком, песок убрать совком [10]. Облитая
щелочью или кислотой одежда первоначально обмывается водой и немедленно
нейтрализуется: в случае кислоты - 2 % раствором аммиака, а в случае щелочи - 5
% раствором уксусной, винной или щавелевой кислоты. В случае возникновения
пожара необходимо данный участок обесточить общим рубильником на силовом щите,
немедленно сообщить о пожаре и месте его возникновения дежурному пожарной
охраны и принять меры к его тушению имеющимися противопожарными средствами
(огнетушитель, песок, кошма и др.). В случае получения травмы необходимо
освободить пострадавшего от действия травмирующего фактора, обстановку на месте
аварии сохранить такой, какой она была в момент происшествия, если это не
угрожает опасностью другим, оказать пострадавшему первую доврачебную
медицинскую помощь, вызвать пострадавшему врача [20].
При работах с использованием лабораторных центрифуг необходимо проверить
состояние центрифуги, смазку, надежность крепления деталей. Перед загрузкой
центрифуги проверить, нет ли в барабане и на кожухе центрифуги посторонних
предметов. Затем закрыть крышку кожуха центрифуги и проверить исправность ее
блокировки. Следует непрерывно наблюдать за работой центрифуги. Если возникают,
какие-либо неисправности, необычный шум или стук, немедленно сообщить об этом
руководителю работ. Перегрузка барабанов центрифуги не допускается. К тому же,
во избежание биения барабана в центрифугах не допускается односторонней
перегрузки барабана. Во избежание травм разгружать центрифугу следует только
после полной остановки барабана [9].
При работе с лабораторными животными опасными факторами являются:
·
дезинфицирующие
средства (дихлофос, карбофос и др.);
·
инфицирование
естественными инфекционными болезнями экспериментальных животных, возбудители
которых являются патогенными для человека;
·
инфицирование
инфекционными болезнями животных, зараженных возбудителями опасными для людей;
·
укусы животных.
Во время работы с животными при выполнении всех операции необходимо быть
спокойными, уверенными, но не грубыми. Не допускать резких окриков. Животные
должны содержаться в клетках с надежно запирающимися дверками. Для переноски
животных используют переносные ящики или клетки. После использования ящик или
клетку дезинфицируют. При обслуживании животных необходимо пользоваться
кожаными или стеганными рукавицами. При ловле животных применяются сачки,
ловушки, рогатки, а для фиксации пасти - специальные зажимы или тесемки. При
укусах животными необходимо промыть рану раствором перекиси водорода,
обработать йодом и наложить стерильную повязку [14].
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
.1 Объект исследования
В работе использовались 3х-месячные крысы-самцы линии Wistar массой
140-225г, содержавшиеся в стандартних условиях вивария Харьковского
национального университета им. В.Н. Каразина.
Животные были разделены на 2 группы с помощью теста «Открытого поля» до
эксперимента по количеству физиологических отправлений. Открытое поле - это
хорошо освещенная квадратная арена 1Ч1 м, стенкой 50 см, пол которой размечен
линиями на квадраты.
Крысу выпускали в центральный квадрат, и в течение 5 мин регистрировали
поведенческие реакции, в том числе и уровень дефекации и уринации. Тест
заключается в количественном измерении компонентов поведения животного,
помещенного в новое открытое пространство, выбраться из которого ему мешает
огораживающая арену стенка. Страх, который испытывают животные при помещении их
в новую потенциально опасную среду, сопровождается высоким уровнем дефекации и
уринации. [13]
Таблица 1. Эмоциональный статус и масса крыс, составляющих
экспериментальные группы.
|
1 группа-
высокоэмоциональные животные
|
2 группа-
низкоэмоциональные животные
|
|
n (Число особей в группе)
|
27
|
24
|
|
m (крысы) гр.
|
175,5±21,9
|
167,4±25,4
|
|
m (печени) гр.
|
7,7±1,2
|
7,3±1,4
|
|
N (кол-во физиологических
отправлений)
|
3-8
|
0-2
|
К 1группе (высокоэмоциональные животные) отнесли крыс с количеством
физиологических отправлений от 3<, а ко 2 группе (низкоэмоциональных
животных) менее 2.
Рабдомиолиз моделировали введением 50%-го водного раствора глицерола в
дозе 1 мл на 100 г массы тела по 0,5 дозы в каждую бедренную мышцу. Животных
декапитировали под легким эфирным наркозом спустя 4ч после введения глицерола.
Манипуляции с животными проводили в соответствии с правилами «Европейской
конвенции защиты позвоночных
животных, которые используются для экспериментальных и других научных
целей » (Страсбург, 1985 г.).
L-Аргинин вводили внутрибрюшинно в дозе 60мг на 100г массы тела за
полчаса до инъекции глицерола.
Контрольным животным вводили соответствующий объем физиологического
раствора [25].
Печень перфузировали охлажденным физиологическим рас твором, и в
гомогенате печени определяли активность тирозинаминотрансферазы (ТАТ, 2.6.1.5 -
L-тирозин :2-оксоглутарат аминотрансфераза). В гомогенатах печени, почек, сердца
и мозга определяли содержание белковых и небелковых SH-групп.
.2 Методы исследования
.2.1 Определение количества белка в тканях по методу Лоури [18]
Принцип метода: Метод основан на способности циклических аминокислот -
триптофана и тирозина, а также полипептидных цепей в комплексе с медью
восстанавливать реактив Фолина. При восстановлении жёлтая окраска реактива
переходит в синий цвет.
Реактивы:
1. 2% раствор Na2CO3 в 0.1 N NaOH. После приготовления фильтруется через
стеклянный фильтр.
20 г. Na2CO3 развести в 1000 мл дистиллированной воды;
2. 1% раствор CuSO4·5H2O и 2% раствор сегнетовой соли - Na- K-тартрата
/Na2C4H4O6 или K2C4H4O6/ смешивают как 1:1.
3. Реактив Фолина: 100 г. вольфрамата натрия /Na2WO4·2H2O/ и 25 г.
молибдата натрия /Na2MoO4·2H2O/ растворяют в 700 мл дистиллированной воды. К
раствору добавляют 50 мл 80% раствора фосфорной кислоты и 100 мл
концентрированной соляной кислоты. К колбе присоединяют обратный холодильник и
смесь кипятят в течении 10 часов. После чего в колбу добавляют 150 г 50 мл
дистиллированной воды и 3-5 капель брома /Br2/. Смесь кипятят без холодильника
15 мин под тягой для удаления избытка брома. Затем смесь охлаждают до комнатной
температуры,доводят до объёма 1л, и фильтруют через стеклянный фильтр и хранят
в тёмном стекле с притёртой пробкой. Полученный раствор должен быть
ярко-жёлтого цвета. Перед работой определяют концентрацию кислоты в полученном
растворе. Для этого реактив титруют 1 N NaOH по фенолфталейну: 1 мл реактива
Фолина ,250 мл дистиллированной воды,5-10 капель 1% фенолфталейна и титруют
1 N NaOH до розовой окраски.
4. Физиологический раствор. 0.09г NaCl развести в 100 мл дистиллированной
воды.
5. 0.15 М КСl 10 мл.
- 0.112 г КСl
- 9.888 мл дистиллированной воды.
6. 7 % раствор трихлоруксусной кислоты.
7. 0.1 N NaOH 100 мл.
. Реактив А: 1 мл реактива 2 смешать с 50 мл реактива 1.
. Рабочий раствор альбумина: 1 мл которого содержит 10 мг белка.
Методика определения белка в тканях.
Животное декапитируем, извлекаем печень, промываем физиологическим
раствором и просушиваем фильтровальной бумагой. Навеску ткани 100 мг
гомогенизируем в 4 мл 0.15М КСl. Отобрать 0.5 мл гомогената, развести
дистиллированной водой в соотношении 1:2 и перемешать. Отобрать 0.1 мл
разведённого гомогената, добавить 0.4 мл 7 % ТХУ и центрифугировать 5 мин при
1500 обор/мин. Осадок растворить в 0.1 N NaOH, добавляя его до объёма 0.1 мл.
Затем добавить 9 мл реактива А и опять перемешать. Дать постоять 10 мин при
комнатной температуре. Прилить 0.9 мл реактива Фолина и опять перемешать. После
чего оставить пробы при комнатной температуре на 1 час. Затем колориметрировать
против холостой пробы на ФЕКе при красном светофильтре с длиной волны 540-750
нм и длиной оптического пути 1 см.
Холостую пробу готовят следующим способом: в пробирку отмерить 9.1 мл
реактива А, добавить 0.9 мл реактива Фолина и тщательно перемешать.
Количество белка в пробе определить при помощи калибровочного графика.
Для построения графика используют водный раствор кристаллического альбумина
сыворотки быка.
Из этого раствора готовят ряд разведений следующим способом согласно
схеме:
|
Исходный раствор белка,мл
|
Дистиллированная вода,мл
|
Концентрация белка,мкг/мл
|
0.1 мл содержит белка в мкг
|
|
0.1
|
0.9
|
1000
|
100
|
|
0.2
|
0.8
|
2000
|
200
|
|
0.3
|
0.7
|
3000
|
300
|
|
0.4
|
0.6
|
4000
|
400
|
|
0.5
|
0.5
|
5000
|
500
|
Из полученных рабочих растворов отобрать пробы по 0.1 мл и провести
цветную реакцию по прописи. На оси абсцисс откладываем концентрацию белка в
мкг, на оси ординат - величину экстинции и строим кривую.
Норма белка в ткани: 100-200 мг/г ткани.
.2.2 Определение активности тирозинаминотрансферазы по методу Шепарда
[18]
Для определения активности тирозинаминотрансферазы (ТАТ) брали 1 гр
печени крыс и гамогенезировали в 4 мл К-фосфатного буфера (рН=7,6).
Реактивы:
1. L-Тирозин
2. α-Кетоглутаровая кислота
. Диэтилдитиокарбамат
. Пиридоксальфосфат
. Феназинметасульфат
. 0,75 М фосфатный буфер рН=7,0 (готовят перед опытом)
. 0,14М KCl фосфатный буфер рН=7,6
Метод:
Активность тирозинаминотрансферазы исследуется по определению увеличения
концентрации р-оксифенилпирувата в инкубированных образцах (контроль - при
нулевой температуре), измеряя экстинцию окраски, образующейся при
взаимодействии этого метаболита с феназинметасультфатом. Смесь для определения
активности содержит 0,1 мл печеночной фракции, 6 ммолей L-тирозина, 0,1 ммоль
пиридоксальфосфата, 5 ммолей α-кетоглутаровой кислоты и 100 ммолей
фосфатного буфера (рН=7,6), в общем объеме 3 мл, депротеинировали, добавляя 1,0
мл 20% фосфорной кислоты при t=-0 C (контроль) и после 20-минутной инкубации
при t=-37 C (опыт). 1,0 мл депротеинированных смесей добавляли к 4 мл раствора
феназинметасульфата рН=7,0. После 1 ч развития окраски при комнатной
температуре в месте, защищенном от световых лучей, измеряли поглощение света на
ФЭКе при длине волны 670нм, кювета толщиной 10,0 мм.
Активность фермента выражается в единицах (нмоли образовавшегося
р-оксифенилпирувата/мин при условиях инкубации) на мг белка.
Расчет активности фермента:
Тканевая активность (мкмоль/мин на 1гр ткани):
А=10,25*а,
где а-мкмоль р-ОПФ в пробе,
,25 - коэффициент, учитывающий разведение и перевод полученных данных в
мкмоль на 1 г ткани печени за 1 мин.
Удельная активность (нмоль/мин на мг белка):
С=А/В,
где А-тканевая активность, мкмоль/мин на гр ткани,
В-количество мг белка на 1 г ткани печени.
.2.3 Определение количества SH-групп в печени, почках, сердце и мозге
крыс методом Фоломеева [18]
Количество сульфгидрильных групп определяли методом Фоломеева в
модификации. Фотоколориметрический ультрамикрометод количественного определения
сульфгидрильных групп белка и небелковых соединений.
Принцип метода:
Метод основан на эквивалентном взаимодействии молекулярного йода со
свободными SH-группами белков и низкомолекулярных соединений в присутствии 3М
KI, а также фосфатного буфера рН=7,6, при температуре среды более 20С. О
количестве йода, прореагировавшего с SH-группами, судят по результатам
сравнения опытной и контрольной проб на фотоэлектроколориметре (ФЭК).
Реактивы:
1. 3М KI (готовят перед опытом)
2. 5% раствор крахмала (готовят каждый день)
. 0,1н раствор I2(готовят раз в неделю)
. 0,001н раствор I2 (готовят из 0,1н раствора I: 0,1 мл 0,1н
раствора I +9,9мл Н2О)
. 0,14 М KCl фостфатный буфер рН=7,6
. 7% ТХУ
Ход работы:
Определение общих сульфгидрильных групп:
К 0,1 мл супернатанта (20% гомогенат печени) добавляют 2мл 3М KI, 0,1 мл
5% раствора крахмала и 3 мл фосфатного буфера рН=7,6 (общий объем равен 5, 2
мл). Пробу перемешивают и в кювете с длиной оптического пути 10 мм и помещают в
ФЭК против контрольной пробы. Стрелку гальванометра и шкалу экстинций устанавливают
на нуле. Затем в пробу вносят 0,1 мл 0,001н раствора I2, тщательно перемешивают
и колориметрируют через 10с после внесения йода в пробу. Длина волны 490нм.
Контрольную пробу на реактивы колориметрируют аналогично. О количестве SH-групп
в пробе судят по количеству йода (в эквивалентах), взаимодействующего с
тиогруппами.
Расчет проводят по формуле:
Х=0,1*(Ек-Ео)/Ек,
где Х-количество SH-групп (в мкмоль)
,1-количество йода, вносимого в пробу (в мкэкв)
Ек и Ео-экстинции соответственно контрольной и опытной проб
Определение SH-небелковых соединений
К 0,1 мл супернатанта (полученного из гомогената с добавлением 7% ТХУ в
соотношении 1:1, после центрифугирования в течение 5 мин при 3000 об/мин)
добавляют 2 мл 3М KI, 0,1 мл 5% раствора крахмала и 3 мл фосфатного буфера
рН=7,6. Пробу перемешивают и в кювете с длинной оптического пути 10мм помещают
в ФЭК против контрольной пробы. Стрелку гальванометра и шкалу экстинций
устанавливают на нуле. Затем в пробу вносят 0,1 мл 0,001н раствора I2,
тщательно перемешивают и колориметрируют через 10сек после внесения йода в
пробу. Длина волны 490 нм.
Содержание SH-групп белков определяют по разнице концентраций общих и
небелковых SH-групп.
.3 Статистическая обработка результатов
Проверка нормальности распределения оценивалась по критерию Шапиро-Уилка.
Учитывая нормальное распределение данных, для каждой группы рассчитывались
средние значения и стандартные отклонения. Для оценки достоверности различий
между группами использовался t-тест Стьюдента для независимых переменных [1].
ГЛАВА 4.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Рис. 4. Содержание белковых SH-групп у контрольных животных 1 и 2 групп
(*-р<0,05 по отношению к 1й группе).
Рис. 5. Содержание небелковых SH-групп у контрольных животных 1 и 2
групп.
Из рис. 4 видно, что содержание белковых SH-групп в контроле печени и
почек высокоэмоциональных животных в 2,7 и в 2,2 раза соответственно выше, чем
в контроле низкоэмоциональных животных. Таким образом, установлено различие в
содержании белковых SH-групп в печени и почках крыс с различным эмоциональным
статусом.
Реактивность к стрессу, стрессоустойчивость, являются основным критерием
приспособленности и жизнеспособности при изменении условий обитания, в
экстремальных ситуациях и при других стрессовых воздействиях.
Выявлено, что для «эмоциональных» крыс, отобранных в тесте “открытого
поля”, характерно более высокое содержание продуктов свободнорадикального
окисления липидов в мозге, печени, сердце до и после стресса по Десидерато в
сравнении с «неэмоциональными» животными. Устойчивость животных к
эмоциональному стрессу зависит и от содержания в гипоталамусе отдельных
олигопептидов, таких как β-эндорфин и вазопрессин. При этом показано, что у
устойчивых к эмоциональному стрессу животных наблюдается более высокое
содержание указанных олигопептидов, чем у предрасположенных к стрессу. Наиболее
характерным признаком устойчивости животных к эмоциональному стрессу оказался
высокий уровень содержания НА в гипоталамусе.
Показано, что не любые эмоции, а именно отрицательные эмоции
пассивно-оборонительного характера приводят к развитию и /или усугублению
течения патологических синдромов различного генеза. Выявлены генетические и
индивидуальные различия в устойчивости к эмоциональному стрессу. Обнаружена
связь между устойчивостью к эмоциональному стрессу и содержанием биогенных
аминов и нейропептидов - субстанции Р, дельта-сон-индуцирующего пептида (DSIP),
бета-эндорфина, пролактина и др. в различных структурах мозга. Установлено антистрессовое
действие пептидов, показаны различия в устойчивости к эмоциональному стрессу у
особей с индивидуально-типологическими особенностями поведения [11].
Содержание НА и А в различных отделах головного мозга снижается в
состоянии страха. Выраженный феномен дефекации в ОП связан с низкой
концентрацией НА в гипотоламусе. Снижение содержания НА в ЦНС приводит к
увеличению эмоциональности у крыс. Реакция ярости характеризуется повышением
содержания НА и А в гипоталамусе. Эмоциональная реактивность крыс зависит не
только от нервной системы, но и от эндокринной. Так, увеличение содержания АКТГ
повышает боязливость и снижает агрессивность у животных. Эмоциональность
рассматривается как реакция страха и развивается в первую очередь благодаря
активации холинэргических механизмов головного мозга [13].
Таблица 2. Содержание небелковых SH-групп в печени высокоэмоциональных
животных.
|
Контроль
|
Глицерол
|
Аргинин
|
Аргинин+глицерол
|
|
х±m (мкмоль на 1г тк)
|
12,23 ± 3,34
|
9,44 ± 4,16
|
11,11 ± 3,37
|
9,38 ± 3,04
|
|
n
|
9
|
6
|
6
|
6
|
|
100%
|
100
|
77
|
91
|
77
|
|
p
|
|
p>0,05
|
p>0,05
|
p>0,05
|
Таблица 3. Содержание небелковых SH-групп в печени низкоэмоциональных
животных.
|
Контроль
|
Глицерол
|
Аргинин
|
Аргинин+глицерол
|
|
х±m (мкмоль на 1г тк)
|
12,15 ± 3,41
|
7,96 ± 2,13
|
10,15 ± 2,2
|
6,06 ± 2,4
|
|
n
|
6
|
6
|
6
|
6
|
|
100%
|
100
|
66
|
84
|
50
|
|
p
|
|
р<0,05
|
p>0,05
|
р<0,05
|
Рис. 6 Содержание небелковых SH-групп в печени крыс при введении
глицерола и аргинина (*-р<0,05 по отношению к контролю).
Из таблицы 3 и рисунка 6 видно, что содержание небелковых SH-групп в
печени 2й группы животных снижается при действии глицерола в 1,5 раза, а при
совместном действии аргингина с глицеролом в 2 раза.
Введение глицерола, видимо, способствует развитию оксидативного стресса и
образование свободных радикалов, активных форм кислорода и азота, и аткивацией
ферментов антиоксидантной защиты. Введение крысам аргинина, вероятно, оказывало
прооксидантное дейсвтие, на что указывает снижение небелковых SH-групп и может
свидетельствовать об их окислении в процессе защиты от АФК и реакционно
способных метаболитов.
Таблица 4. Содержание небелковых SH-групп в почках высокоэмоциональных
животных
|
Контроль
|
Глицерол
|
Аргинин
|
Аргинин+глицерол
|
|
х±m (мкмоль на 1г тк)
|
14,08 ± 4,65
|
9,87 ± 1,67
|
11,31 ±3,32
|
8,3 ± 2,61
|
|
n
|
9
|
6
|
6
|
6
|
|
100%
|
100
|
70
|
80
|
59
|
|
p
|
|
p>0,05
|
p>0,05
|
p>0,05
|
Таблица 5. Содержание небелковых SH-групп в почках низкоэмоциональных
животных.
|
Контроль
|
Глицерол
|
Аргинин
|
Аргинин+глицеол
|
|
х±m (мкмоль на 1г тк)
|
13,04 ± 3,67
|
10,71 ± 2,72
|
8,58 ± 2,66
|
7,37 ± 1,85
|
|
n
|
6
|
6
|
6
|
6
|
|
100%
|
100
|
82
|
66
|
57
|
|
p
|
|
p>0,05
|
р<0,05
|
р<0,05
|
Рис. 7 Содержание небелковых SH-групп в почках крыс при введении
глицерола и аргинина (*-р<0,05 по отношению к контролю).
Из табл. 5 и рисунка 7 видно, что содержание небелковых SH-групп в почках
2й группы животных снижается в 1,5 раза при действии аргинина и в 1,8 раз при
действии аргинина с глицеролом.
В последнее время показано, что введение аргинина может приводить к
усилению синтеза NO в организме. Этот феномен известен как «аргининовый
парадокс». Так, при выраженных воспалительных процессах, а также индукции
соответствующей формы NO-синтазы и развитии оксидативного стресса, введение
аргинина может не только не оказать терапевтического действия, но даже ухудшить
состояние за счет гиперпродукции пероксинитрита и других токсичных реактивных
форм азота.
Физиологические и токсические функции NO реализуются в результате сложных
химических превращений, основными участниками которых являются переходные
металлы, тиолы, кислород, супероксид и другие радикалы. При этом реализуются
прямые и опосредованные другими активными формами азота пути действия NO [6].
Таблица 6. Содержание небелковых SH-групп в серце высокоэмоциональных
животных.
|
Контроль
|
Глицерол
|
Аргинин
|
Аргинин+глицерол
|
|
х±m (мкмоль на 1г тк)
|
9,41 ± 2,81
|
8,51 ± 3,95
|
11,53 ± 4,24
|
6,14 ± 2,21
|
|
n
|
9
|
6
|
6
|
6
|
|
100%
|
100
|
90
|
123
|
65
|
|
p
|
|
p>0,05
|
p>0,05
|
р<0,05
|
Таблица 7. Содержание небелковые SH-групп в сердце низкоэмоциональных
животных.
|
Контроль
|
Глицерол
|
Аргинин
|
Аргинин+глицерол
|
|
х±m (мкмоль на 1г тк)
|
10,41 ± 2,85
|
6,43 ± 3,5
|
5,67 ± 2,2
|
5,53 ± 2,95
|
|
n
|
6
|
6
|
6
|
6
|
|
100%
|
100
|
62
|
54
|
53
|
|
p
|
|
p>0,05
|
p<0,05
|
p<0,05
|
Рис. 8 Содержание небелковых SH-групп в сердце крыс при введении
глицерола и аргинина (*-р<0,05 по отношению к контролю).
Как видно из рисунка 8 и табл. 6 и 7, содержание небелковых SH-групп в
сердце 2 группы животных снижается при действии аргинина и совместном действии
аргинина с глицеролом в 1,8 и 1,9 раз соответственно. Также отмечено снижение и
в 1й группе животных при совместном действии аргинина и глицерола в 1,5 раза.
Введение аргинина оказывает прооксидантное дейсвтие, что связано со снижение
небелковых SH-групп и свидетельствует об их окислении. Совместное введение
аргинина и глицерола еще более усиливает прооксидантный эффект.
Таблица 8. Содержание небелковых SH-групп в мозге высокоэмоциональных
животных.
|
Контроль
|
Глицерол
|
Аргинин
|
Аргинин+глицерол
|
|
х±m (мкмоль на 1г тк)
|
11,19 ± 4,74
|
9,39 ± 2,24
|
9,79 ± 4,04
|
6,89 ± 2,72
|
9
|
6
|
6
|
6
|
|
100%
|
100
|
84
|
87
|
62
|
|
p
|
|
p>0,05
|
p>0,05
|
p>0,05
|
Таблица 9. Содержание небелковых SH-групп в мозге низкоэмоциональных
животных.
|
Контроль
|
Глицерол
|
Аргинин
|
Аргинин+глицеpол
|
|
х±m (мкмоль на 1г тк)
|
11,56 ± 3,36
|
7,82 ± 2,95
|
6,22 ± 1,78
|
6,24 ± 4,0
|
|
n
|
6
|
6
|
6
|
6
|
|
100%
|
100
|
68
|
54
|
54
|
|
p
|
|
p>0,05
|
p<0,05
|
p<0,05
|
Рис. 9 Содержание небелковых SH-групп в мозге крыс при введении глицерола
и аргинина (*-р<0,05 по отношению к контролю).
Как видно из табл. 9 и рисунка 9, содержание небелковых SH-групп в мозге
2й группы животных снижается под действием аргинина и совместном действии
аргинина с глицеролом в 1,9 раз. Снижение небелковых SH-групп, вероятно,
связано с их окисленим и образованием окисленнях S-S соединений, а также их
включение в окислительные реакции. Небелковые тиолы оказывают в этих условиях
антиоксидантные свойства, восстанавливая различные окисленные субстраты.
Аргинин - субстрат NO-синтаз, и известны антиоксидантные свойства NO в
связи с его способностью связываться с гемом и тем самым ограничивать его
прооксидантный эффект. Поэтому при предварительном введение аргинина ожидалось
снижение проокислительных эффектов глицерола (в этом случае введение аргинина
перед глицеролом должно было бы нормализовать или хотя бы уменьшить эффекты
глицерола). Этого не было обнаружено, а, напротив, было выявлено действие
аргинина, подобное глицеролу (снижение небелковых тиогрупп). Введение аргинина,
вероятно, оказывает прооксидантное дейсвтие, на что указывает снижение
небелковых SH-групп и свидетельствует об их окислении. Это связано, вероятно, с
высокой продукцией пероксинитрита. В данной работе использовались не
физиологические дозы аргинина и, вероятно, по этому его введение не только не
оказало терапевтического действия, но даже ухудшило состояние за счет
гиперпродукции пероксинитрита и других токсичных реактивных форм азота.
Таблица 10. Содержание белковых SH-групп в печени высокоэмоциональных
животных.
|
Контроль
|
Глицерол
|
Аргинин
|
Аргинин+глицеpол
|
|
х±m (мкмоль на 1г тк)
|
13,48 ± 3,06
|
12,87 ± 2,74
|
10,63 ± 5,7
|
11,29 ± 4,28
|
|
n
|
7
|
6
|
5
|
5
|
|
100%
|
100
|
95
|
79
|
84
|
|
p
|
|
p>0,05
|
p>0,05
|
p>0,05
|
Таблица 11. Содержание белковых SH-групп в печени низкоэмоциональных
животных.
|
Контроль
|
Глицерол
|
Аргинин
|
Аргинин+глицеpол
|
|
х±m (мкмоль на 1г тк)
|
4,93 ± 1,9
|
10,45 ± 4,82
|
16,19 ± 3,94
|
15,64 ± 3,85
|
|
n
|
4
|
6
|
4
|
4
|
|
100%
|
100
|
212
|
328
|
317
|
|
p
|
|
р<0,05
|
р<0,05
|
р<0,05
|
Рис. 10. Содержание белковых SH-групп в печени крыс при введении
глицерола и аргинина (*-р<0,05 по отношению к контролю).
Из рисунка 10 и табл. 11 видно, что содержание белковых SH-групп в печени
2й группы животных повышается при введении глицерола, аргинина и аргинина с
глицеролом в 2,1, 3,3 и 3,2 раза соответственно. Повышение белковых SH- групп в
печени может быть связано с адаптивным синтезом SH-cодержащих белков, таких как
металлотионеины, что может происходить при поступлении в организм металлов и
увеличении в крови глюкокортикоидов.
Таблица 12. Содержание белковых SH-групп в почках высокоэмоциональных
животных.
|
Контроль
|
Глицерол
|
Аргинин
|
Аргинин+глицеpол
|
|
х±m (мкмоль на 1г тк)
|
9,69 ± 5,05
|
11,57 ± 3,54
|
9,65 ± 3,04
|
9,13 ± 5,77
|
|
n
|
6
|
6
|
5
|
3
|
|
100%
|
100
|
119
|
100
|
94
|
|
p
|
|
p>0,05
|
p>0,05
|
p>0,05
|
Таблица 13. Содержание белковых SH-групп в почках низкоэмоциональных
животных
|
Контроль
|
Глицерол
|
Аргинин
|
Аргинин+глицеpол
|
|
х±m (мкмоль на 1г тк)
|
4,38 ± 1,19
|
11,48 ± 6,46
|
12,92 ± 4,16
|
10,16 ± 4,95
|
|
n
|
4
|
6
|
6
|
6
|
|
100%
|
100
|
127
|
143
|
113
|
|
p
|
|
р<0,05
|
р<0,05
|
р<0,05
|
Рис. 11. Содержание белковых SH-групп в почках крыс при введении
глицерола и аргинина (*-р<0,05 по отношению к контролю).
Как видно из табл. 13 и рисунка 11, содержание белковых SH-групп в почках
крыс 2й группы повышается при действии глицерола, аргинина и совместном
действии аргинина и глицерола в 2,6, 2,9 и 2,3 раза соответственно. Повышение
содержания белковых SH-групп в почках может свидетельствовать об интенсивном
синтезе SH-содержащих белков.
Таблица 14. Содержание белковых SH-групп в сердце высокоэмоциональных
животных
|
Контроль
|
Глицерол
|
Аргинин
|
Аргинин+глицеpол
|
|
х±m (мкмоль на 1г тк)
|
15,61 ± 8,19
|
11,42 ± 3,51
|
9,34 ± 4,01
|
12,57 ± 3,18
|
|
n
|
8
|
6
|
6
|
4
|
|
100%
|
100
|
73
|
60
|
81
|
|
p
|
|
p>0,05
|
p>0,05
|
p>0,05
|
Таблица 15. Содержание белковых SH-групп в сердце низкоэмоциональных
животных.
|
Контроль
|
Глицерол
|
Аргинин
|
Аргинин+глицеpол
|
|
х±m (мкмоль на 1г тк)
|
10,85 ± 4,54
|
17,42 ± 4,42
|
15,98 ± 4,22
|
11,27 ± 4,14
|
|
n
|
5
|
6
|
5
|
5
|
|
100%
|
100
|
161
|
147
|
104
|
|
p
|
|
р<0,05
|
p>0,05
|
p>0,05
|
Рис. 12. Содержание белковых SH-групп в сердце крыс при введении
глицерола и аргинина (*-р<0,05 по отношению к контролю).
Из табл. 15 и рисунка 12 видно, что содержание белковых SH-групп в сердце
2й группы животных увеличивается при действии глицерола в 1,6 раз. Это
повышение может быть связано с интенсивным синтезом в серце низкоэмоциональных
крыс SH-содержащих белков, которое происходит при большом поступлении
глюкокортикоидов, так как они оказывают значительное стимулирующее влияние на
функции миокарда, и повышают системное кровяное давление. Глюкокортикоиды
способствуют гипертрофии миокарда при длительном воздействии, так как
активируют синтез белка и нуклеиновых кислот в сердечной мышце. Суммарный
эффект гормонов стресса на сердечно-сосудистую систему приводит к стимуляции ее
гиперфункции, ускорению транспорта крови, а значит - кислорода и субстратов.
Таблица 16. Содержание белковых SH-групп в мозге высокоэмоциональных
животных.
|
Контроль
|
Глицерол
|
Аргинин
|
Аргинин+глицеpол
|
|
х±m (мкмоль на 1г тк)
|
12,31 ± 3,28
|
10,47 ± 1,43
|
10,82 ± 4,44
|
3,73 ± 1,31
|
|
n
|
7
|
6
|
6
|
4
|
|
100%
|
100
|
85
|
88
|
30
|
|
p
|
|
p>0,05
|
p>0,05
|
р<0,05
|
Таблица 17. Содержание белковых SH-групп в мозге низкоэмоциональных
животных.
|
Контроль
|
Глицерол
|
Аргинин
|
Аргинин+глицеpол
|
|
х±m (мкмоль на 1г тк)
|
13,02 ± 6,08
|
14,73 ± 5,98
|
11,19 ± 8,66
|
4,12 ± 2,62
|
|
n
|
3
|
6
|
5
|
4
|
|
100%
|
100
|
113
|
86
|
32
|
|
p
|
|
p>0,05
|
p>0,05
|
p>0,05
|
Рис. 13. Содержание белковых SH-групп в мозге крыс при введении глицерола
и аргинина (*-р<0,05 по отношению к контролю).
Как видно из табл. 17 и рисунка 13, содержание белковых SH-групп в мозге
снижается при совместном действии аргинина и глицерола в 1й группе животных в
3,3 раза. Совместное введение этих веществ влияет на SH-cодержащие белковые
молекулы, которые могут окисляться и образовывать S-S соединения. Окисление
SH-групп белков сопровождается изменением их структуры, свойств и
каталитической активности, и таким образом наблюдается падение содержания
белковых SH-групп.
На основании полученных данных видно, что влияние введения глицерола и
аргинина на содержание небелковых и белковых тиолов более выражено у животных
2й группы.
Таблица 18. Активность ТАТ высокоэмоциональных животных.
|
Контроль
|
Глицерол
|
Аргинин
|
Аргинин+глицеpол
|
|
х±m нмоль р-ОФП/мин на 1 мг
белка
|
22,91 ± 6,34
|
9,18 ± 7,28
|
5,33 ± 1,39
|
8,84 ± 2,81
|
|
n
|
9
|
6
|
6
|
6
|
|
100%
|
100
|
40
|
23
|
39
|
|
p
|
|
р<0,05
|
р<0,05
|
р<0,05
|
Таблица 19. Активность ТАТ низкоэмоциональных животных
|
Контроль
|
Глицерол
|
Аргинин
|
Аргинин+глицеpол
|
|
х±m нмоль р-ОФП/мин на 1 мг
белка
|
21,94 ± 9,93
|
6,32 ± 5,31
|
3,29 ± 1,79
|
16,46 ± 6,19
|
|
n
|
5
|
6
|
6
|
6
|
|
100%
|
100
|
29
|
15
|
75
|
|
p
|
|
р<0,05
|
р<0,05
|
p>0,05
|
Рис. 14. Активность тирозинаминотрансферазы в печени крыс при введении
глицерола и аргинина (*-р<0,05 по отношению к контролю).
Как видно из табл. 18, 19 и рисунка 14, активность TAT понижается под
действием глицерола в 1й и 2й группе животных в 2,4 и 3,5 раза соответственно.
При действии аргинина активность снижается в 4,3 и 6,7 раз. Совместное действие
аргинина и глицерола привело к снижению активности ТАТ в 1й группе животных в
2,6 раз, в то время как во 2й группе не было достоверного снижения активности
фермента.
Снижение активности ТАТ может быть вызвано деградацией фермента,
обусловленной АФК и азота при оксидативном стрессе, вызванном введением
глицерола, блокированием его синтеза путем влиянием на экспрессию генов NO
(подавление репликации ДНК и уменьшение содержания мРНК) или изменением
каталитической активности, вызванной свободными радикалами. Использование
нефизиологических концентраций аргинина обуславливает способность NO выступать
в качестве токсического агента и, возможно, влиять на активность и синтез ТАТ.
Оксид азота вызывает также ингибирование связывающей способности
глюкокортикоидных рецепторов и может, таким образом, препятствовать экспрессии
гена ТАТ.и супероксид-анион подвергаются быстрому радикал-радикальному
взаимодействию с образованием медиатора окислительного клеточного повреждения -
пероксинитрита. Пероксинитрит вызывает повреждение белков и липидов клеточных
мембран, что может способствовать утечке ТАТ из клетки. При этом NO легко
проходит через внешнюю и внутреннюю мембраны клеток и, оказавшись внутри
клетки, он повреждает ДНК клетки-мишени путем ее дезаминирования, а также
ингибировать рибонуклеотидредуктазу, которая регулирует скорость репликации
ДНК. Это и объясняет цитотоксическое действие NO на клетку-мишень [6].
ВЫВОДЫ
1. Выявлены
базовые различия в содержании белковых SH-групп у крыс с различным
эмоциональным статусом: у низкоэмоциональных животных этот показатель ниже, чем
у высокоэмоциональных, в печени и почках.
2. Введение
глицерола вызывало снижение содержания небелковых SH-групп в печени
низкоэмоциональных животных.
. Введение
аргинина вызывало снижение содержания небелковых SH-групп в почках, сердце и
мозге низкоэмоциональных крыс.
. Совместное
введение аргинина и глицерола вызывало снижение содержания небелковых SH-групп
во всех исследуемых органах низкоэмоциональных и в сердце высокоэмоциональных
крыс.
. Введение
глицерола вызывало увеличение содержания белковых SH-групп в печени, почках и
сердце, а введение аргинина вызывало аналогичный эффект в печени и почках
низкоэмоциональных крыс.
. Совместное
введение аргинина и глицерола вызывало снижение содержания бекловых SH-групп в
мозге высокоэмоциональных животных.
. Введение
глицерола и аргинина вызывало снижение активности тирозинаминотрансферазы у
животных обеих групп, при этом, совместное введение аргинина и глицерола
вызывало снижение активности тирозинаминотрансферазы у животных 1й группы.
. В
исследованный нами срок более выраженные изменения изучаемых показателей при
введении глицерола и аргинина были выявлены у низкоэмоциональных животных.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Атраментова Л.О., Утевська О.М. Статистичнi методи в
бiологii: пiдручник. - Х: ХНУ iменi Каразiна, 2007.- 288с.
2. Березуцький В.В. Науково-практичний коментар до Закону
України про охорону праці.-Х.Вид-во Форт.-2009.-379.
3. Висвесваран П., Гунтупалли Я. Чрезвычайные
воздействия окружающей среды. Рабдомиолиз// Клинические лекции по медицине
критических состояний.-1999.- Том 15, № 2.
. Гаджиев В. Г. Изучение гормональной регуляции и
тканеспецифической экспрессии гена тирозинаминотрансферазы у крыс: Автореф.
дис. канд. біол. наук. - Москва, 1992. - 150с.
. Горчакова Н.А., Гудивок Я.С., Гунина Л.М. под общ.
ред. Олейника С.А., Гуниной Л.М., Сейфуллы Р.Д Фармакология спорта.- К.:
Олимп.-л-ра, 2010.
. Дмитриенко Н.П., Кишко Т.О., Шандренко С.Г. Аргинин:
биологическое действие, влияние на синтез оксида азота.// Украинский
химиотерапевтический журнал. - 2008.-№2. -22c.
. ДНК участок GRE: Расположение. [Электронный ресурс]
Режим доступа:
<http://humbio.ru/humbio/endocrinology/0010ed72.htm#000b0833.htm>
8. Дорожко Е. В. Определение некоторых тиоловых соединений
в биологических объектах методом вольтамперометрии: Автореф. дис. на соискание
ученой степени кандидата химических наук. - Томск, 2010. - 22с.
. Инструкция по охране труда №69 при эксплуатации
лабораторных центрифуг; утв. приказом ректора университета 25.02.2008г. №
0108-4/117.
10. Инструкция по охране труда №71 при выполнении работ в
лабораторіях биологического профиля; утв. приказом ректора университета
25.02.2008г. № 0108-4/117.
. Исмайлова, Х. Ю., Агаев, Т. М., Семенова, Т. П.
Индивидуальные особенности поведения: (моноаминергические механизмы). - Баку:
«Нурлан», 2007. - 228 с.
12. Костюшов В.В., Костюшова Л.А., Тымчишин О.Л., Костюшова
Н.В., Ратушненко В.А. Феномен высвобождения небелковых SH-групп при
взаимодействии белков острой фазы сыворотки крови с антисыворотками и его
диагностическое значение [Электронный ресурс]: Центральный военный клинический
госпиталь, г. Одесса.
Режим доступа:
<http://www.ecologylife.ru/ekologiya-goroda/page/6>
13. Кулагин Д.А. Болондинский В.К. Нейрохимические аспекты
эмоциональной реактивности и двигательной активности крыс в новой обстановке//
Успехи физиологических наук. -1986.-Том 17; №1.-92.
14. Лабораторная крыса (справочний материал)//
Лабораторные животные.-1993. -Т.3.
. Морозов И.В., Смагулова Ф.О., Сотникова Н.В.,
Мертвецов Н.П. Нуклеотидная последовательность гена ТАТ крысы. Новосибирский
институт биоорганической химии СО РАН. Биоорганичиская химия, 1999.- Том 25,
№4.-312-320с.
. Морозов И. В. Сравнительный
структурно-функциональный анализ генов тирозинаминотрансферазы человека и
крысы: Автореф. дис. канд. биол. наук. - Новосибирск, 1998. - 132 с.
. Органическая химия. [Электронный ресурс]:
Серосодержащие соединения.
Режим доступа:
<http://www.chemistry.ru/course/content/chapter12/section/paragraph4/subparagraph8.html>
18. Охрименко С. М., Гурьева Н. Ю., Калиман П. А. // Вісник
ХНУ. Серія: Біологія. -2005. - № 1-2. - 56-60c.
19. Подковкин В.Г., Иванов Д.Г. Изменение показателей
метаболизма коллагена у крыс с различным эмоциональным статусом при остром
стрессе// Успехи современного естествознания. - 2008. - № 11. - 17-21с.
. Правила безпечної роботи з хімічними речовинами у
вищих та середніх спеціалізованих навчальних закладах, на підприємствах і в
установах систем Держосвіти СРСР (НПАОП 80.0-1.01-89), наказ від 13.10.89р.
Держосвіти СРСР.
. Северин Е.С. Биохимия: Учеб. для вузов, 2003.- 779
с.
. Сера. [Электронный ресурс]: Столица-Медикл
Режим доступа:
http://smed.ru/guides/190/#article <http://smed.ru/guides/190/>
23. Солопов В.Н., Резников И.И., Чучалин А.Г. Роль
серосодержащих соединений в патогенезе и лечении хронических неспецифических
заболеваний легких. // «Клиническая медицина».- 1988.- №6.- 60-63с.
24. Торчинский Ю. М., Сульфгидрильные и дисульфидные
группы белков.- М.: Изд-во «Наука», 1971.-225с.
. Филимоненко В. П., Никитченко И. В., Калиман П. А.
// Укр. бiохім. журн.-2009. - 81, № 1. - 34-43с.
. Химия органических соединений серы, под ред. Л. И.
Беленького.- М.: Мир, 1988.-320с.
. Чарыева, Г. Х. Индукция тирозинаминотрансферазы
печени при гипертермии: Автореф. дис. канд. биол. наук. - Ашхабад, 1985. -
160с.
. Чугасова В. Антиоксиданты природные и
синтезированные. [Электронный ресурс]: Cosmetics & Medicine.
Режим доступа:
<http://www.cmjournal.com/rp326.htm>
29. Boshart M., Falk Weih F., Schmidt A., Fournier K.,
Schьtz G. A cyclic AMP response element mediates repression of tyrosine
aminotransferase gene transcription by the tissue-specific extinguisher locus
Tse-1// Cell.-1990. - V.61.-P. 905-916.
30. Brumback, R.A., Feeback, D.L., and Leech, R.W.
Rhabdomyolysis in childhood. // Paediatric Neurology. - 1992. - V.39, №4. - Р.
821-858.
31. Fujimoto S. S., Fujino M., Matsuda K., Maeda M., Ohira
H., Kawasaki K., Tamaki N. Mechanism of liver tyrosine aminotransferase
increase in ethanol-treated mice and its effect on serum tyrosine level//
Journal of Nutritional Science and Vitaminology.-2007.-V.53;№6.-P.489-95
[Abstract].
32. Goldman L., Ausiello D. Rabdomyolysis// Cecil
Medicine.-2007.-V.23; chap 114.
33. Holt S., Moore K. Pathogenesis of renal failure in
rhabdomyolysis: The role of myoglobin // Exp. Nephrol. - 2000. - Vol. 8. - P.
72-76.
34. Jackson M. J., Jones D.A., Edwards R.H.T.
Experimental skeletal muscle damage: the nature of the calcium activated
degenerative processes// Eur J Clin Invest.-1984.-V. 14.-P. 369-374.
. Kakulas B.A., Mastaglia, F.L. Drug-induced, toxic
and nutritional myopathies//Skeletal Muscle Pathology.-1992.-2ed. - P. 511-540.
. Knochel, J.P. Hypophosphataemia and rhabdomyolysis//
J Clin Invest.-1992.-V.5.- P. 455-457.
. Knochel, J.P. Mechanisms of rhabdomyolysis. Current
Opinion in Rheumatology// J Clin Invest.-1993.-V.5.- P.725-731.
38. Mehere P
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mehere%20P%22%5BAuthor%5D>.,
Han Q
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Han%20Q%22%5BAuthor%5D>.,
Lemkul J.A
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lemkul%20JA%22%5BAuthor%5D>.,
Vavricka C.J <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vavricka%20CJ%22%5BAuthor%5D>.,
Robinson H
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Robinson%20H%22%5BAuthor%5D>.,
Bevan D.R
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bevan%20DR%22%5BAuthor%5D>.,
Li J <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Li%20J%22%5BAuthor%5D>.
Tyrosine aminotransferase: biochemical and structural properties and molecular
dynamics simulations// Protein Cell.- 2010.- V.11.-P.1023-32.
39. Miller M.S
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Miller%20MS%22%5BAuthor%5D>.,
Wogan G.N
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wogan%20GN%22%5BAuthor%5D>.
Inhibition of steroid-inducible tyrosine aminotransferase gene expression by
N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine in a rat hepatoma cell line//
Carcinogenesis. <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2873903>
-1986.-V.8.-P.1273-8 [Abstract].
. Morel Yannick,
Barouki Robert. Repression of gene expression by oxidative stress// Biochem.
J.- 1999.- V.342. Pt 3. - P.481-496 [Abstract].
. Patsoukis Nikolaos,
Papapostolou Ioannis, Zervoudakis George, Georgiou Christos D., Matsokis
Nikolaos A., Panagopoulos Nikolaos. Thiol redox state and oxidative stress in
midbrain and striatum of weaver mutant mice, a genetic model of nigrostriatal
dopamine deficiency// Neuroscience Letters.-2005.-V. 376, Issue 1
<http://www.sciencedirect.com/science/journal/03043940/376/1>.- P. 24-28
[Abstract].
. Penn A.S.
Myoglobinuria// West J Med. 1986.-V. 2. - P.1785-1805 [Abstract].
43. Poels P.J.E., Gabreлls F.J.M. Rhabdomyolysis// Clin
Neurol & Neurosurg.-1993.- V.95, Issue 3.-P.175-192.
. Shelly L. L., Tynan W., Schmid W., Schtitz G., Yeoh G.
C. T. Hepatocyte Differentiation In Vitro: Initiation of Tyrosine
Aminotransferase Expression in Cultured Fetal Rat Hepatocytes// The Journal of
Cell Biology.-1989.- V. 109, Issue 6.-P. 3403-3410.
. Shenton D., Smirnova J.B., Selley J.N., Carroll K.
Hubbard S. J., Pavitt G.D., Ashe M.P., Grant C.M. Global Translational
Responses to Oxidative Stress Impact upon Multiple Levels of Protein Synthesis//The
journal of biological chemistry.-2006.-V. 281, № 39.- Р. 29011-29021.
. Sivaraman S., Kirsch J.F. The narrow substrate
specificity of human tyrosine aminotransferase-the enzyme deficient in
tyrosinemia type II // FEBS J.-2006.-V.27, №9.-Р.1920-9.
. Wellingera R., Guigoz Yves. The effect of age on the
induction of tyrosine aminotransferase and tryptophan oxygenase genes by
physiological stress// Mech Ageing Dev.-1986.-V.34, № 2.- Р. 203-17[Abstract].
. Woodrow G., Brownjohn A.M., Turney J.H. The clinical
and biochemical features of acute renal failure due to rhabdomyolysis // Renal
Fail. - 1995. - Vol. 17. - P. 467-474.
50. Zager R.A. Rhabdomyolysis and myohemoglobinuric acute
renal failure// Kidney International.-1996.-V.49.- Р. 314-326.